Plante- og patogenmaterialer
En sorghum-foreningskortlægningspopulation kendt som sorghum-konverteringspopulationen (SCP) blev leveret af Dr. Pat Brown ved University of Illinois (nu ved UC Davis).Det er blevet beskrevet tidligere og er en samling af forskellige linjer omdannet til fotoperiode-ufølsomhed og mindre statur for at lette væksten og udviklingen af planterne i amerikanske miljøer.510 linjer fra denne population blev brugt i denne undersøgelse, men på grund af dårlig spiring og andre kvalitetskontrolproblemer blev ikke alle linjer brugt i analysen af alle tre egenskaber.I sidste ende blev data fra 345 linjer brugt til analysen af chitin-responset, 472 linjer til flg22-responset og 456 til TLS-resistens.B. cookeistamme LSLP18 blev opnået fra Dr. Burt Bluhm ved University of Arkansas.
MAMP-responsmåling
To forskellige MAMP'er blev brugt i denne undersøgelse flg22, (Genscript catalogue# RP19986) og chitin.Sorghumplanter blev dyrket i indsatser lagt på flade fyldt med jord (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) i drivhuset.Planterne blev vandet dagen før prøveudtagningen for at undgå ekstra bladfugt på dagen for indsamlingen.
Linjerne blev randomiseret og af logistiske årsager plantet i partier på 60 linier.For hver linje blev der plantet tre 'potter' med to frø pr. linje.Efterfølgende partier blev plantet, så snart det foregående parti var blevet behandlet, indtil hele populationen var blevet vurderet.To eksperimentelle kørsler blev udført for begge MAMP'er med genotyper re-randomiseret i hver af de to kørsler.
ROS-assays blev udført som tidligere beskrevet.Kort fortalt, for hver linje blev der plantet seks frø i 3 forskellige potter.Fra de resulterende frøplanter blev tre udvalgt baseret på ensartethed.Frøplanter, der så usædvanlige ud eller var væsentligt højere eller kortere end de fleste, blev ikke brugt.Fire bladskiver med 3 mm diameter blev skåret ud fra den bredeste del af det 4. blad af tre forskellige 15 dage gamle sorghumplanter.En skive pr. blad fra to planter og to skiver fra en plante, hvor den anden skive bliver vandkontrollen (se nedenfor).Skiverne blev individuelt svævet på 50 µl H20 i en sort 96-brønds plade, forseglet med en aluminiumsforsegling for at undgå udsættelse for lys og holdt ved stuetemperatur natten over.Næste morgen blev der fremstillet en reaktionsopløsning under anvendelse af 2 mg/ml kemiluminescerende probe L-012 (Wako, katalognr. 120-04891), 2 mg/ml peberrodsperoxidase (Type VI-A, Sigma-Aldrich, katalognr. P6782) og 100 mg/ml chitin eller 2 μM Flg22.50 µl af denne reaktionsopløsning blev tilsat til tre af de fire brønde.Den fjerde brønd var en falsk kontrol, hvortil reaktionsopløsningen ekskl. MAMP blev tilsat.Fire blanke brønde, der kun indeholdt vand, var også inkluderet i hver plade.
Efter tilsætning af reaktionsopløsningen blev luminescensen målt ved hjælp af SynergyTM 2 multi-detektions mikropladelæser (BioTek) hvert 2. minut i 1 time.Pladelæseren tager luminescensmålinger hvert 2. minut i løbet af denne 1 time.Summen af alle 31 aflæsninger blev beregnet for at give værdien for hver brønd.Den estimerede værdi for MAMP-responset for hver genotype blev beregnet som (gennemsnitlig luminescensværdi for de tre eksperimentelle brønde - den falske brøndværdi) - minus den gennemsnitlige blanke brøndværdi.Blindbrøndværdierne var konsekvent tæt på nul.
Bladskiver afNicotiana benthamiana, en højresponsiv sorghumlinje (SC0003) og en lavresponsiv sorghumlinje (PI 6069) blev også inkluderet som kontroller i hver 96-brønds plade til kvalitetskontrolformål.
B. cookeiinokulumfremstilling og podning
B. cookeiinokulum blev fremstillet som beskrevet tidligere.Kort fortalt blev sorghum korn gennemblødt i vand i tre dage, skyllet, hældt i 1 liter koniske kolber og autoklaveret i en time ved 15 psi og 121 °C.Kornene blev derefter podet med ca. 5 ml macereret mycelia fra en frisk kultur afB. cookeiLSLP18 isoleres og efterlades i 2 uger ved stuetemperatur, idet kolberne rystes hver 3. dag.Efter 2 uger blev de svampeangrebne sorghumkorn lufttørret og derefter opbevaret ved 4 °C indtil markpodning.Det samme inokulum blev brugt til hele forsøget og lavet frisk hvert år.Til podning blev 6-10 angrebne korn placeret i hvirvlen af 4-5 uger gamle sorghumplanter.Sporerne produceret fra disse svampe initierede infektion i de unge sorghumplanter inden for en uge.
Frø forberedelse
Før plantning i marken blev sorghumfrø behandlet med et fungicid, insekticid og safener-blanding indeholdende ~ 1% Spirato 480 FS fungicid, 4% Sebring 480 FS fungicid, 3% Sorpro 940 ES frøbeskytter.Derefter blev frøene lufttørret i 3 dage, hvilket gav en tynd belægning af denne blanding omkring frøene.Beskyttelsesmidlet tillod brugen af herbicidet Dual Magnum som en præ-emergence-behandling.
Evaluering af målbladpletresistens
SCP'en blev plantet på Central Crops Research Station i Clayton, NC den 14.-15. juni 2017 og den 20. juni 2018 i et randomiseret komplet blokdesign med to eksperimentelle replikationer i hvert tilfælde.Eksperimenter blev plantet i 1,8 m enkelte rækker med en rækkebredde på 0,9 m under anvendelse af 10 frø pr. plot.To kantrækker blev plantet rundt i periferien af hvert eksperiment for at forhindre kanteffekter.Forsøgene blev podet den 20. juli 2017 og den 20. juli 2018, hvorpå sorghumplanterne var i vækststadie 3. Vurderinger blev taget på en skala fra 1 til 9 , hvor planter, der ikke viste tegn på sygdom, blev scoret som en ni og fuldstændigt. døde planter blev bedømt som én.To vurderinger blev taget i 2017 og fire aflæsninger i 2018, der starter to uger efter podning hvert år.sAUDPC (standardiseret areal under sygdomsprogressionskurve) blev beregnet som beskrevet tidligere.
Posttid: 01-04-2021