Pesticider spiller en afgørende rolle i at håndtere global fødevaremangel og bekæmpe vektorbårne menneskelige sygdomme. Det voksende problem med pesticidresistens kræver dog presserende opdagelsen af nye forbindelser, der er målrettet mod underudnyttede mål. Insekttransientreceptorpotentiale (TRPV)-kanaler - Nanzhong (Nan) og inaktive (Iav) - kan danne heterologe kanaler (Nan-Iav) og lokaliseres til mekanosensoriske organer, der medierer geotropisme, hørelse og proprioception hos insekter. Nogle pesticider, såsom aphidopyrrolidon (AP), målretter Nan-Iav gennem ukendte mekanismer. AP er effektiv mod piercingsugende insekter (hemipteraner) og forhindrer fødeindtagelse ved at forstyrre filamenternes funktion. AP kan kun binde til Nan, men kun Nan-Iav kan interagere med agonister, herunder endogent nikotinamid (NAM), og derved udvise kanalaktivitet. På trods af Nan-Iavs potentiale som et insekticidmål vides der kun lidt om dets kanalsamling, regulatoriske bindingssteder og Ca2+-afhængig regulering, hvilket hindrer yderligere insekticidudvikling. I dette studie blev kryo-elektronmikroskopi brugt til at bestemme strukturen af Nan-Iav i Hemiptera-insekter i calmodulin-ligandfri tilstand, såvel som med AP og NAM ved grænsen af det ankyrin-gentagne cytoplasmatiske domæne (ARD). Overraskende nok fandt vi, at Nan-proteinet i sig selv kan danne en pentamer, som stabiliseres af AP-medierede ARD-interaktioner. Dette studie afslører molekylære interaktioner mellem insekticider og agonister og Nan-Iav, hvilket fremhæver vigtigheden af ARD i kanalfunktion og -samling og udforsker mekanismen bag Ca2+-regulering.
På baggrund af stadig mere alvorlige globale klimaforandringer er forværret global fødevaresikkerhed en af det 21. århundredes største udfordringer med kaskaderende konsekvenser for samfundet.1,2Verdenssundhedsorganisationens rapport om fødevaresikkerhed og ernæring i verden 2023 (SOFI) anslår, at cirka 2,33 milliarder mennesker verden over lider af moderat til svær fødevareusikkerhed, et langvarigt problem.3,4Desværre går anslået 20 % til 30 % eller mere af afgrødeudbyttet årligt tabt til skadedyr og patogener, og global opvarmning forventes at forværre skadedyrsresistens og afgrøders sårbarhed.4, 5, 6, 7, 8Udvikling af pesticider er afgørende ikke kun for at beskytte afgrøder mod skadedyr og reducere spredningen af vektorbårne patogener, men også for at bekæmpe vektorbårne menneskelige sygdomme som denguefeber, malaria og Chagas sygdom, som i stigende grad er resistente over for pesticider.5,9,10,11
Blandt de vigtigste mål for neurotoksiske insekticider repræsenterer den heterotetrameriske TRPV-kanal Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) en klasse af insekticidmål, der først er blevet opdaget i det sidste årti, herunder kommercielt tilgængelige insekticider såsom imidacloprid og pyraclostrobin.12,13,14Det semisyntetiske insekticid aphidopyrrolifen (AP) er et nyligt udviklet og kommercialiseret produkt, hvis hovedkomponent er det aktive insekticid Inscalis®, som binder AP på et subnanomolært aktivitetsniveau.15AP udviser lav akut toksicitet over for bestøvere, gavnlige insekter og andre ikke-målorganismer, og når det anvendes i henhold til etikettens anvisninger, kan det reducere resistenspresset over for andre insekticider.16,17,18Nan og Iav er vidt fordelt på tværs af insektarter, udtrykkes kun co-neuroner i kordale strækreceptorneuroner i antenner og lemmer, og er afgørende for hørelse, tyngdekraftsopfattelse og proprioception.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidacloprid og pyraclostrobin stimulerer Nan-Iav-komplekset gennem en unik mekanisme, der i sidste ende hæmmer proprioceptiv signaltransduktion.13,16,23Hos piercingsugende insekter (hemipteraer) såsom bladlus og hvidfluer forringer tab af proprioception deres fødeindtag, hvilket i sidste ende fører til døden.13,24Interessant nok udviser AP høj affinitet for Nan-Iav-komplekset og lav affinitet for Nan alene. Binding af AP til Nan-Iav inducerer en elektrisk strøm, men binding til Nan alene stimulerer ikke kanalaktivitet. Iav i sig selv binder slet ikke til AP.16Dette tyder på, at Nan og Iav kan binde sig og danne forskellige Nan-Iav-kanalkomplekser (f.eks. med forskellige støkiometriske forhold eller forskellige arrangementer inden for det samme støkiometriske forhold), eller at AP kan binde sig til flere steder. Desuden binder den naturlige agonist nikotinamid (NAM) sig til Drosophila Nan-Iav med mikromolær affinitet og udviser effekter svarende til dem, der ses hos bladlus (AP) in vitro.16,25og hæmmer bladlusens reproduktion og fødedannelse, hvilket i sidste ende fører til deres død25,26Disse data rejser mange spørgsmål. For eksempel er det fortsat uklart, hvordan Nan-Iav-heterodimeren dannes, hvilke bindingssteder der bruges til at modulere små molekyler, og hvordan disse små molekyler regulerer kanalfunktionen ved at undertrykke proprioception. Desuden er årsagerne til, at Nan i sig selv er inaktivt og har lav affinitet for AP, mens Nan-Iav-heterodimeren er aktiv og binder AP med højere affinitet, fortsat uklare. Endelig vides der kun lidt om den Ca2+-afhængige regulering af Nan-Iav-funktionen, og hvordan den er integreret i neuronale signalprocesser.. 13,21
I dette studie, der kombinerede kryo-elektronmikroskopi, elektrofysiologi og radioligandbindingsteknikker, belyste vi sammensætningen af Nan-Iav og mekanismen for dets binding til småmolekyleregulatorer. Derudover detekterede vi konstitutivt bundet calmodulin (CaM) til Iav og AP-stabiliserede Nan-pentamerer. Disse resultater giver vigtig indsigt i reguleringen af calciumioner i kanaler, kanalsammensætning og de faktorer, der bestemmer ligandbindingsaffinitet. Endnu vigtigere bekræftede vi, at ARD spiller en central rolle i disse processer. Vores studie af komplette insektkanaler bundet til relevante landbrugspesticider27, 28, 29åbner perspektiver for udviklingen af pesticidindustrien, forbedrer pesticidernes effektivitet og specificitet og muliggør anvendelse af TRPV-målrettede forbindelser på andre arter for at imødegå global fødevaresikkerhed og spredningen af vektorbårne sygdomme.
Vi fandt også, at Nan-Iav reguleres af Ca2+, og at reguleringsmekanismen medieres af konstitutivt bundet CaM. Det er vigtigt at bemærke, at denne Ca2+-afhængige regulering af Nav af CaM adskiller sig væsentligt fra reguleringsmekanismerne for andre ionkanaler (f.eks. spændingsstyrede Na+-kanaler og TRPV5/6-kanaler).52, 53, 54, 55, 56, 57I Nav1.2-kanalen associerer CaMs C-terminale domæne spiralformet med det C-terminale domæne (CTD), og Ca2+ inducerer binding af dets N-terminale domæne til den distale del af CTD.56I TRPV5/6-kanalen binder CaMs C-terminale domæne sig til CTH, og Ca2+ inducerer en opadgående forlængelse af dets N-terminale domæne ind i poren, hvorved kationpermeabiliteten blokeres.53,54Vi foreslår en model for den Ca2+-regulerede funktion af Nan-Iav-CaM (fig. 4h). I denne model binder det N-terminale domæne af CaM konstitutivt til det C-terminale domæne (CTH) af Iav. I hviletilstand (lav [Ca2+]-koncentration) interagerer det C-terminale domæne af CaM med Nan, stabiliserer ARD-konformationen og fremmer derved kanalåbning. Binding af en agonist/insekticid til kanalen inducerer poreåbning, hvilket fører til Ca2+-influx. Ca2+ binder derefter til CaM, hvilket forårsager dissociation af det C-terminale domæne fra ARD'en af Nan. Fordi blokering af CaM-binding i det væsentlige ophæver den hæmmende effekt af Ca2+, modulerer denne dissociation ARD-mobilitet og forårsager derved Ca2+-afhængig hæmning eller desensibilisering. Den hurtige genopretning af kanalstrømme efter calciumioneluering (fig. 4g) antyder, at denne mekanisme fremmer hurtige reaktioner på Ca2+-medierede neuronale signaler. Derudover er det blevet rapporteret, at C-terminalregionen af Iav, som stadig er dårligt forstået, spiller andre roller i kanalretning og nuværende regulering.21
Endelig præsenterer vores undersøgelse den højopløselige struktur af et insekticid-insekticid TRP-kanalkompleks af landbrugsmæssig betydning – en opdagelse, der tidligere var ukendt for os. Det er værd at bemærke, at vi karakteriserede strukturen og funktionen af insektkanalen i humane celler (HEK293S GnTi–) snarere end i insektceller. I lyset af voksende insekticidresistens og det løbende pres på fødevaresikkerhed og patogener giver vores arbejde vigtig information, der vil fremme udviklingen af nye insekticider til gavn for menneskers sundhed og global fødevaresikkerhed. Undersøgelser har vist, at insekticider som AP er effektive mod nogle skadedyr, når de anvendes i henhold til etikettens anvisninger, og har lav akut toksicitet for gavnlige bestøvere, hvilket demonstrerer deres miljøsikkerhed.13,16Desuden har test af nogle AP-derivater på myg vist, at de med tiden mister deres evne til at flyve. Forståelse af, hvordan disse modulerende forbindelser binder til Nan-Iav, vil fremme modifikationen af eksisterende forbindelser eller udviklingen af nye forbindelser for mere effektive ogpræcisSkadedyrsbekæmpelse. Vores undersøgelse viser, at Nan-Iav ARD-grænsefladen er kritisk, ikke kun for at regulere aktiviteten af endogene forbindelser, pesticider og Ca2+-CaM, men også for kanalsamling. Vi foreslår, at det at forstyrre heterodimersamlingen med små molekyler kan være en unik og lovende tilgang til udvikling af ionkanalhæmmere.
Ud af de otte ortologe gener blev fuldlængdegenerne fra den brune bille (Halyomorpha halys) Nanchung og Inactive udvalgt, som udviste fremragende stabilitet i detergenter. De syntetiserede gener blev kodonoptimeret til human ekspression og klonet ind i pBacMam pCMV-DEST-vektoren (Life Technologies) ved hjælp af XhoI- og EcoRI-restriktionssteder. Dette sikrede, at klonerne var i ramme med de C-terminale GFP-FLAG-10xHis- og mCherry-FLAG-10xHis-mærker, som spaltes af HRC-3C-protease (PPX), hvilket muliggør uafhængigudtrykPrimerne, der blev brugt til at klone Nanchung og Inactive ind i pBacMam-vektoren, var som følger:
Mikroskopiske billeder af individuelle partikler blev taget på et Titan Krios G2 transmissionselektronmikroskop (FEI) udstyret med et K3-kamera og et Gatan BioQuantum-energifilter. Mikroskopet blev betjent ved 300 keV, med en energiindstilling på 20 eV, en prøvepixelstørrelse på 1,08 Å/pixel (nominel forstørrelse på 81.000x) og en defokusgradient fra -0,8 til -2,2 μm. Videooptagelse blev udført med 40 billeder i sekundet ved hjælp af et Latitude S-mikroskop (Gatan) med en nominel dosishastighed på 25 e–px−1 s−1, en eksponeringstid på 2,4 s og en samlet dosis på cirka 60 e–Å−2.
Stråleinduceret bevægelseskorrektion og dosisvægtning blev udført på film ved hjælp af MotionCor2 i RELION 4.061. Kontrastoverføringsfunktion (CTF) parameterestimering blev udført i cryoSPARC ved hjælp af den patch-baserede CTF-estimeringsmetode62. Fotomikrografer med en CTF-tilpasningsopløsning ≥4 Å blev ekskluderet fra efterfølgende analyse. Typisk blev en delmængde på 500-1000 fotomikrografer brugt til punktudvælgelse i cryoSPARC, efterfulgt af flere runder med 2D-klassificering efter filtrering for at opnå et klart referencebillede til skabelonbaseret partikeludvælgelse. Partiklerne blev derefter ekstraheret ved hjælp af 64-pixel afgrænsningsbokse og 4-fold binning. Flere runder med 2D-klassificering blev udført for at fjerne uønskede partikelkategorier. Den indledende 3D-model blev rekonstrueret ved hjælp af ab initio-rekonstruktion og raffineret ved hjælp af ikke-ensartet raffinering i cryoSPARC. 3D-klassificering blev udført i cryoSPARC eller RELION baseret på ARD-heterogenitet. Der blev ikke observeret nogen signifikant heterogenitet af membrandomæner. Partiklerne blev raffineret ved hjælp af C1- og C2-metoderne; Partikler med højere C2-opløsning blev betragtet som symmetriske i forhold til C2 og importeret til RELION til Bayesiansk raffinering. Partiklerne blev derefter overført tilbage til cryoSPARC til endelig ikke-ensartet og lokal raffinering. Den endelige opløsning og partikelantal er vist i tabel 1.
Ved behandling af Nan+AP-pentamerer undersøgte vi forskellige metoder til at forbedre opløsningen af membrandomæner (især poreområdet), såsom signalsubtraktion og TMD-maskering. Disse forsøg var dog mislykkede på grund af den potentielt ekstreme uorden i poreområdet og den samlede heterogenitet af TMD'en. Den endelige opløsning blev beregnet ved hjælp af en maske, der automatisk blev genereret af den ikke-ensartede behandlingsmetode i cryoSPARC, primært rettet mod ARD-regionen. Dette opnåede en signifikant højere opløsning end membrandomænernes (især VSLD-regionen).
Indledende de novo-modeller af apo-formerne af Nanchung- og Inactive-bugs blev først genereret ved hjælp af Coot63, og modeller af Nan- og Iav-bugs blev genereret ved hjælp af AlphaFold264 for at identificere regioner med lav konfidens. Calmodulin-modellering var baseret på rigid-body-tilpasninger af Ca2+-bindende og Ca2+-fri modeller i henholdsvis PDB-tilføjelserne 4JPZ56 og 1CFD65. Modellerne blev raffineret ved hjælp af sfærisk raffinement for at sikre korrekt stereokemi og god geometri. Phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin og phosphatidylserin blev derefter modelleret som veldefinerede lipiddensiteter, og NAM- og AP-liganderne blev placeret i de tilsvarende densiteter i de tætte forbindelser. Begrænsningsfiler blev genereret fra SMILES-strengen af isoformerne ved hjælp af eLBOW i PHENIX66. Endelig blev modellerne raffineret i realrummet i PHENIX ved hjælp af lokal grid-søgning og global minimering med sekundære strukturbegrænsninger. MolProbity-serveren blev brugt til modelforfining og strukturel analyse, og illustrationer blev udført ved hjælp af PyMOL og UCSF Chimera X. 67,68,69 Aperturanalyse blev udført ved hjælp af HOLE-serveren,70 og sekvensbevarelseskortlægning blev udført ved hjælp af Consurf-serveren.71
Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Igor Pro 6.2, Excel Office 365 og GraphPad Prism 7.0. Alle kvantitative data præsenteres som middelværdi ± standardfejl (SEM). Student's t-test (tosidet, uparret) blev brugt til at sammenligne to grupper. Envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Dunnett's post hoc-test blev brugt til at sammenligne flere grupper. *P< 0,05, **P< 0,01, og ***P< 0,001 blev betragtet som statistisk signifikant afhængigt af datafordelingen. Kd- og Ki-værdier og deres asymmetriske 95%-konfidensintervaller blev beregnet ved hjælp af GraphPad Prism 10.
For yderligere oplysninger om studiets metode, se venligst resuméet af Nature Portfolio Report, der er linket i denne artikel.
Den oprindelige model blev bygget ved hjælp af calmodulin-modellerne fra PDB 4JPZ- og 1CFD-databaserne. Koordinaterne er blevet deponeret i Protein Data Bank (PDB) under accessionsnumrene 9NVN (Nan-Iav-CaM uden ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM bundet til nikotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM bundet til nikotinamid og EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM bundet til aphenidolpyrrollin og calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM bundet til aphenidolpyrrollin og EDTA) og 9NVS (Nan-pentamer bundet til aphenidolpyrrollin). De tilsvarende kryo-elektronmikroskopibilleder er deponeret i Electron Microscopy Database (EMDB) under følgende accessionsnumre: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM uden ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-kompleks med nikotinamid), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-kompleks med nikotinamid og EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-kompleks med aphidopyrrollin og calcium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-kompleks med aphidopyrrollin og EDTA) og EMD-49849 (Nan-pentamerkompleks med aphidopyrrollin). De rådata til den funktionelle analyse præsenteres i denne artikel.
Opslagstidspunkt: 28. januar 2026