Det anthelmintiske lægemiddel N,N-diethyl-m-toluamid (DEET) er blevet rapporteret at hæmme AChE (acetylcholinesterase) og har potentielle kræftfremkaldende egenskaber på grund af overdreven vaskularisering. I dette papir viser vi, at DEET specifikt stimulerer endotelceller, der fremmer angiogenese og derved øger tumorvækst. DEET aktiverer cellulære processer, der fører til angiogenese, herunder proliferation, migration og adhæsion. Dette er forbundet med øget NO-produktion og VEGF-ekspression i endotelceller. Silencing af M3 eller brug af farmakologiske M3-hæmmere afskaffede alle disse virkninger, hvilket tyder på, at DEET-induceret angiogenese er M3-følsom. Eksperimenter, der involverer calciumsignalering i endotel- og HEK-celler, der overudtrykker M3-receptorer, såvel som bindings- og dockingundersøgelser, indikerer, at DEET fungerer som en allosterisk modulator af M3-receptorer. Desuden hæmmer DEET AChE og øger derved biotilgængeligheden af acetylcholin og dets binding til M3-receptorer og øger proangiogene effekter gennem allosterisk regulering.
Primære EC'er blev isoleret fra aorta hos schweiziske mus. Ekstraktionsmetoden blev tilpasset fra Kobayashi-protokollen 26 . Murine EC'er blev dyrket i EBM-2-medium suppleret med 5% varmeinaktiveret FBS indtil den fjerde passage.
Effekten af to koncentrationer af DEET på proliferationen af HUVEC, U87MG eller BF16F10 blev analyseret under anvendelse af CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kort fortalt blev 5,103 celler pr. brønd podet i en 96-brønds plade, fik lov til at fæstne natten over og derefter behandlet med DEET i 24 timer. Efter fjernelse af vækstmediet tilsættes farvebindende opløsning til hver brønd på mikropladen, og cellerne inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Fluorescensniveauer blev bestemt under anvendelse af en Mithras LB940 multimode mikropladelæser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland) udstyret med 485 nm excitationsfiltre og 530 nm emissionsfiltre.
HUVEC blev podet i plader med 96 brønde ved en tæthed på 104 celler pr. brønd. Celler blev behandlet med DEET i 24 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet under anvendelse af et kolorimetrisk MTT-assay (Sigma-Aldrich, M5655). Optiske tæthedsværdier blev opnået på en multimode mikropladelæser (Mithras LB940) ved en bølgelængde på 570 nm.
Virkningerne af DEET blev undersøgt under anvendelse af in vitro angiogenese-assays. Behandling med 10-8 M eller 10-5 M DEET øgede dannelsen af kapillærlængde i HUVEC'er (fig. 1a, b, hvide søjler). Sammenlignet med kontrolgruppen viste behandling med DEET-koncentrationer fra 10-14 til 10-5 M, at kapillærlængden nåede et plateau ved 10-8 M DEET (Supplerende Fig. S2). Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel i den in vitro proangiogene effekt af HUVEC'er behandlet med DEET i koncentrationsområdet 10-8 M og 10-5 M.
For at bestemme effekten af DEET på neovaskularisering udførte vi in vivo neovaskulariseringsundersøgelser. Efter 14 dage viste mus injiceret med endotelceller fordyrket med 10-8 M eller 10-5 M DEET en signifikant stigning i hæmoglobinindholdet (fig. 1c, hvide søjler).
Endvidere blev DEET-induceret neovaskularisering undersøgt i U87MG xenograft-bærende mus, der blev injiceret dagligt (ip) med DEET i en dosis, der vides at inducere plasmakoncentrationer på 10-5 M, hvilket er normalt hos udsatte mennesker. i 23. Påviselige tumorer (dvs. tumorer >100 mm3) blev observeret 14 dage efter injektion af U87MG-celler i mus. På dag 28 var tumorvækst signifikant forøget i DEET-behandlede mus sammenlignet med kontrolmus (fig. Id, firkanter). Desuden viste CD31-farvning af tumorer, at DEET signifikant øgede kapillærområdet, men ikke mikrokardensiteten. (Fig. 1e–g).
For at bestemme rollen af muskarine receptorer i DETA-induceret proliferation blev 10-8 M eller 10-5 M DETA i nærvær af pFHHSiD (10-7 M, en selektiv M3-receptorantagonist) anvendt. Behandling af HUVEC. pFHHSiD blokerede fuldstændigt de proliferative egenskaber af DETA ved alle koncentrationer (tabel 1).
Under disse forhold undersøgte vi også, om DEET ville øge kapillærlængden i HUVEC-celler. Tilsvarende forhindrede pFHHSiD signifikant DEET-induceret kapillærlængde (fig. 1a, b, grå søjler). Endvidere blev lignende eksperimenter udført med M3 siRNA. Selvom kontrol-siRNA'et ikke var effektivt til at fremme kapillærdannelse, ophævede lyddæmpning af M3-muscarinreceptoren DEET's evne til at øge kapillærlængden (fig. 1a, b, sorte bjælker).
Desuden blev både 10-8 M eller 10-5 M DEET-induceret vaskularisering in vitro og neovaskularisering in vivo fuldstændig blokeret af pFHHSiD (fig. 1c, d, cirkler). Disse resultater indikerer, at DEET fremmer angiogenese gennem en vej, der er følsom over for selektive M3-receptorantagonister eller M3-siRNA.
AChE er det molekylære mål for DEET. Lægemidler såsom donepezil, der fungerer som AChE-hæmmere, kan stimulere EC-angiogenese in vitro og i muse bagbens-iskæmimodeller14. Vi testede effekten af to koncentrationer af DEET på AChE enzymaktivitet i HUVEC. Lave (10-8 M) og høje (10-5 M) koncentrationer af DEET reducerede endotel AChE-aktivitet sammenlignet med kontrolbetingelser (fig. 2).
Begge koncentrationer af DEET (10-8 M og 10-5 M) reducerede acetylcholinesteraseaktivitet på HUVEC. BW284c51 (10-5 M) blev anvendt som kontrol for acetylcholinesterase-hæmmere. Resultater er udtrykt som procentdel af AChE-aktivitet på HUVEC behandlet med de to koncentrationer af DEET sammenlignet med vehikel-behandlede celler. Værdier er udtrykt som middel ± SEM af seks uafhængige eksperimenter. *p < 0,05 sammenlignet med kontrol (Kruskal-Wallis og Dunn multiple sammenligningstest).
Nitrogenoxid (NO) er involveret i den angiogene proces 33, derfor blev NO-produktion i DEET-stimulerede HUVEC'er undersøgt. DEET-behandlet endothelial NO-produktion blev øget sammenlignet med kontrolceller, men nåede kun betydning ved en dosis på 10-8 M (fig. 3c). For at bestemme de molekylære ændringer, der kontrollerer DEET-induceret NO-produktion, blev eNOS-ekspression og aktivering analyseret ved Western blotting. Selvom DEET-behandling ikke ændrede eNOS-ekspression, øgede den signifikant eNOS-phosphorylering på dets aktiveringssted (Ser-1177), mens det reducerede dets hæmmende sted (Thr-495) sammenlignet med ubehandlede celler i eNOS-phosphorylering (fig. 3d). Endvidere blev forholdet mellem phosphoryleret eNOS ved aktiveringsstedet og det hæmmende sted beregnet efter normalisering af mængden af phosphoryleret eNOS til den samlede mængde enzym. Dette forhold blev signifikant forøget i HUVEC'er behandlet med hver koncentration af DEET sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 3d).
Endelig blev ekspressionen af VEGF, en af de vigtigste proangiogene faktorer, analyseret ved Western blotting. DEET øgede signifikant VEGF-ekspression, hvorimod pFHHSiD fuldstændig blokerede denne ekspression.
Da virkningerne af DEET er følsomme over for både farmakologisk blokade og nedregulering af M3-receptorer, testede vi hypotesen om, at DEET kunne forbedre calciumsignalering. Overraskende nok formåede DEET ikke at øge cytoplasmatisk calcium i HUVEC (data ikke vist) og HEK/M3 (fig. 4a, b) for begge anvendte koncentrationer.
Indlægstid: 30. december 2024