Det ormemiddel N,N-diethyl-m-toluamid (DEET) har vist sig at hæmme AChE (acetylcholinesterase) og har potentielt kræftfremkaldende egenskaber på grund af overdreven vaskularisering. I denne artikel viser vi, at DEET specifikt stimulerer endotelceller, der fremmer angiogenese, hvorved tumorvækst øges. DEET aktiverer cellulære processer, der fører til angiogenese, herunder proliferation, migration og adhæsion. Dette er forbundet med øget NO-produktion og VEGF-ekspression i endotelceller. Silencing af M3 eller brug af farmakologiske M3-hæmmere ophævede alle disse effekter, hvilket tyder på, at DEET-induceret angiogenese er M3-følsom. Eksperimenter, der involverer calciumsignalering i endotel- og HEK-celler, der overudtrykker M3-receptorer, samt bindings- og dockingstudier, indikerer, at DEET fungerer som en allosterisk modulator af M3-receptorer. Desuden hæmmer DEET AChE, hvorved biotilgængeligheden af acetylcholin og dets binding til M3-receptorer øges, og proangiogene effekter forstærkes gennem allosterisk regulering.
Primære EC'er blev isoleret fra aortaen hos schweiziske mus. Ekstraktionsmetoden blev tilpasset fra Kobayashi-protokollen 26. Murine EC'er blev dyrket i EBM-2-medium suppleret med 5% varmeinaktiveret FBS indtil den fjerde passage.
Effekten af to koncentrationer af DEET på proliferationen af HUVEC, U87MG eller BF16F10 blev analyseret ved hjælp af CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kort fortalt blev 5,103 celler pr. brønd podet i en 96-brønds plade, fik lov til at hæfte natten over og derefter behandlet med DEET i 24 timer. Efter fjernelse af vækstmediet tilsættes farvestofbindende opløsning til hver brønd i mikropladen, og cellerne inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Fluorescensniveauer blev bestemt ved hjælp af en Mithras LB940 multimode mikropladelæser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland) udstyret med 485 nm excitationsfiltre og 530 nm emissionsfiltre.
HUVEC blev podet i 96-brønds plader med en tæthed på 104 celler pr. brønd. Cellerne blev behandlet med DEET i 24 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved hjælp af et kolorimetrisk MTT-assay (Sigma-Aldrich, M5655). Optiske tæthedsværdier blev opnået på en multimode mikropladelæser (Mithras LB940) ved en bølgelængde på 570 nm.
Effekterne af DEET blev undersøgt ved hjælp af in vitro angiogenese-assays. Behandling med 10-8 M eller 10-5 M DEET øgede dannelsen af kapillærlængde i HUVEC'er (fig. 1a, b, hvide søjler). Sammenlignet med kontrolgruppen viste behandling med DEET-koncentrationer fra 10-14 til 10-5 M, at kapillærlængden nåede et plateau ved 10-8 M DEET (supplerende fig. S2). Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel i den in vitro proangiogene effekt af HUVEC'er behandlet med DEET i koncentrationsområdet 10-8 M og 10-5 M.
For at bestemme effekten af DEET på neovaskularisering udførte vi in vivo neovaskulariseringsstudier. Efter 14 dage viste mus injiceret med endotelceller prækultiveret med 10-8 M eller 10-5 M DEET en signifikant stigning i hæmoglobinindholdet (fig. 1c, hvide søjler).
Desuden blev DEET-induceret neovaskularisering undersøgt i U87MG xenograftbærende mus, der blev injiceret dagligt (ip) med DEET i en dosis, der vides at inducere plasmakoncentrationer på 10-5 M, hvilket er normalt hos eksponerede mennesker. i 23. Detekterbare tumorer (dvs. tumorer >100 mm3) blev observeret 14 dage efter injektion af U87MG-celler i mus. På dag 28 var tumorvæksten signifikant forøget i DEET-behandlede mus sammenlignet med kontrolmus (fig. 1d, firkanter). Desuden viste CD31-farvning af tumorer, at DEET signifikant øgede kapillærarealet, men ikke mikrokartætheden. (fig. 1e-g).
For at bestemme muskarinreceptorers rolle i DETA-induceret proliferation blev 10-8 M eller 10-5 M DETA i nærvær af pFHHSiD (10-7 M, en selektiv M3-receptorantagonist) anvendt. Behandling af HUVEC. pFHHSiD blokerede fuldstændigt DETAs proliferative egenskaber ved alle koncentrationer (Tabel 1).
Under disse forhold undersøgte vi også, om DEET ville øge kapillærlængden i HUVEC-celler. Tilsvarende forhindrede pFHHSiD signifikant DEET-induceret kapillærlængde (fig. 1a, b, grå søjler). Derudover blev lignende eksperimenter udført med M3 siRNA. Selvom kontrol-siRNA'et ikke var effektivt til at fremme kapillærdannelse, ophævede silencing af M3 muskarinreceptoren DEET's evne til at øge kapillærlængden (fig. 1a, b, sorte søjler).
Desuden blev både 10-8 M eller 10-5 M DEET-induceret vaskularisering in vitro og neovaskularisering in vivo fuldstændigt blokeret af pFHHSiD (fig. 1c, d, cirkler). Disse resultater indikerer, at DEET fremmer angiogenese gennem en signalvej, der er følsom over for selektive M3-receptorantagonister eller M3 siRNA.
AChE er det molekylære mål for DEET. Lægemidler som donepezil, der virker som AChE-hæmmere, kan stimulere EC-angiogenese in vitro og i iskæmimodeller af mus i bagbenene14. Vi testede effekten af to koncentrationer af DEET på AChE-enzymaktivitet i HUVEC. Lave (10-8 M) og høje (10-5 M) koncentrationer af DEET reducerede endotel AChE-aktivitet sammenlignet med kontrolforhold (fig. 2).
Begge koncentrationer af DEET (10-8 M og 10-5 M) reducerede acetylcholinesteraseaktiviteten på HUVEC. BW284c51 (10-5 M) blev anvendt som kontrol for acetylcholinesterasehæmmere. Resultaterne er udtrykt som procentdel af AChE-aktivitet på HUVEC behandlet med de to koncentrationer af DEET sammenlignet med vehikelbehandlede celler. Værdierne er udtrykt som middelværdi ± SEM af seks uafhængige eksperimenter. *p < 0,05 sammenlignet med kontrol (Kruskal-Wallis og Dunn multiple comparison test).
Nitrogenoxid (NO) er involveret i den angiogene proces 33, derfor blev NO-produktion i DEET-stimulerede HUVEC'er undersøgt. DEET-behandlet endotel NO-produktion var forøget sammenlignet med kontrolceller, men nåede kun signifikans ved en dosis på 10-8 M (fig. 3c). For at bestemme de molekylære ændringer, der kontrollerer DEET-induceret NO-produktion, blev eNOS-ekspression og -aktivering analyseret ved Western blotting. Selvom DEET-behandling ikke ændrede eNOS-ekspression, øgede den signifikant eNOS-fosforylering på dets aktiveringssted (Ser-1177), mens den mindskede dets hæmmende sted (Thr-495) sammenlignet med ubehandlede celler i eNOS-fosforylering (fig. 3d). Desuden blev forholdet mellem fosforyleret eNOS på aktiveringsstedet og hæmmende stedet beregnet efter normalisering af mængden af fosforyleret eNOS til den samlede mængde enzym. Dette forhold var signifikant forøget i HUVEC'er behandlet med hver koncentration af DEET sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 3d).
Endelig blev ekspressionen af VEGF, en af de vigtigste proangiogene faktorer, analyseret ved Western blotting. DEET øgede VEGF-ekspressionen signifikant, hvorimod pFHHSiD fuldstændigt blokerede denne ekspression.
Da virkningerne af DEET er følsomme over for både farmakologisk blokade og nedregulering af M3-receptorer, testede vi hypotesen om, at DEET muligvis kan forstærke calciumsignalering. Overraskende nok øgede DEET ikke cytoplasmatisk calcium i HUVEC (data ikke vist) og HEK/M3 (fig. 4a, b) for begge anvendte koncentrationer.
Opslagstidspunkt: 30. dec. 2024