I dette studie blev de stimulerende virkninger af den kombinerede behandling afplantevækstregulatorer(2,4-D og kinetin) og jernoxid-nanopartikler (Fe₃O₄-NP'er) på in vitro-morfogenese og sekundær metabolitproduktion i *Hypericum perforatum* L. blev undersøgt. Den optimerede behandling [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP'er (4 mg/L)] forbedrede plantens vækstparametre signifikant: Plantehøjden steg med 59,6%, rodlængden med 114,0%, knopantallet med 180,0% og kallusens friskvægt med 198,3% sammenlignet med kontrolgruppen. Denne kombinerede behandling forbedrede også regenereringseffektiviteten (50,85%) og øgede hypericinindholdet med 66,6%. GC-MS-analyse afslørede høje indhold af hyperosid, β-patolen og cetylalkohol, hvilket tegnede sig for 93,36% af det samlede topareal, mens indholdet af samlede phenoler og flavonoider steg med så meget som 80,1%. Disse resultater indikerer, at plantevækstregulatorer (PGR'er) og Fe₃O₄ nanopartikler (Fe₃O₄-NP'er) udøver en synergistisk effekt ved at stimulere organogenese og akkumulering af bioaktive forbindelser, hvilket repræsenterer en lovende strategi for bioteknologisk forbedring af lægeplanter.
Perikon (Hypericum perforatum L.), også kendt som perikon, er en flerårig urteagtig plante af familien Hypericaceae, der har økonomisk værdi.[1] Dens potentielle bioaktive komponenter omfatter naturlige tanniner, xantoner, phloroglucinol, naphthalenedianthron (hyperin og pseudohyperin), flavonoider, phenolsyrer og æteriske olier.[2,3,4] Perikon kan formeres ved traditionelle metoder; dog begrænser de traditionelle metoders sæsonbestemthed, lav frøspiring og modtagelighed for sygdomme dens potentiale for storskala dyrkning og kontinuerlig dannelse af sekundære metabolitter.[1,5,6]
In vitro-vævskultur betragtes således som en effektiv metode til hurtig planteformering, bevarelse af kimplasmeressourcer og øget udbytte af medicinske forbindelser [7, 8]. Plantevækstregulatorer (PGR'er) spiller en afgørende rolle i reguleringen af morfogenese og er nødvendige for in vitro-dyrkning af kallus og hele organismer. Optimering af deres koncentrationer og kombinationer er afgørende for en vellykket gennemførelse af disse udviklingsprocesser [9]. Derfor er det vigtigt at forstå den passende sammensætning og koncentration af regulatorer for at forbedre væksten og regenerative kapaciteten af perikon (H. perforatum) [10].
Jernoxid-nanopartikler (Fe₃O₄) er en klasse af nanopartikler, der er blevet eller er ved at blive udviklet til vævskultur. Fe₃O₄ har betydelige magnetiske egenskaber, god biokompatibilitet og evnen til at fremme plantevækst og reducere miljøbelastning, så det har tiltrukket sig betydelig opmærksomhed i vævskulturdesign. Potentielle anvendelser af disse nanopartikler kan omfatte optimering af in vitro-kultur for at fremme celledeling, forbedre næringsoptagelse og aktivere antioxidante enzymer [11].
Selvom nanopartikler har vist gode fremmende effekter på plantevækst, er undersøgelser af kombineret anvendelse af Fe₃O₄ nanopartikler og optimerede plantevækstregulatorer i *H. perforatum* fortsat sparsomme. For at udfylde dette hul i viden evaluerede denne undersøgelse virkningerne af deres kombinerede effekter på in vitro morfogenese og sekundær metabolitproduktion for at give ny indsigt i forbedringen af lægeplanters egenskaber. Derfor har denne undersøgelse to mål: (1) optimere koncentrationen af plantevækstregulatorer for effektivt at fremme kallusdannelse, skudregenerering og roddannelse in vitro; og (2) evaluere virkningerne af Fe₃O₄ nanopartikler på vækstparametre in vitro. Fremtidige planer omfatter evaluering af overlevelsesraten for regenererede planter under akklimatisering (in vitro). Det forventes, at resultaterne af denne undersøgelse vil forbedre mikropropageringseffektiviteten af *H. perforatum* betydeligt og derved bidrage til bæredygtig anvendelse og bioteknologiske anvendelser af denne vigtige lægeplante.
I dette studie opnåede vi bladeksplantater fra feltdyrkede etårige perikonplanter (moderplanter). Disse eksplantater blev brugt til at optimere in vitro-dyrkningsbetingelserne. Før dyrkning blev bladene grundigt skyllet under rindende destilleret vand i flere minutter. Eksplantaternes overflader blev derefter desinficeret ved nedsænkning i 70% ethanol i 30 sekunder, efterfulgt af nedsænkning i en 1,5% natriumhypochlorit (NaOCl)-opløsning indeholdende et par dråber Tween 20 i 10 minutter. Endelig blev eksplantaterne skyllet tre gange med sterilt destilleret vand, før de blev overført til det næste dyrkningsmedium.
I løbet af de næste fire uger blev skudregenereringsparametre målt, herunder regenereringshastighed, antal skud pr. eksplantat og skudlængde. Når de regenererede skud nåede en længde på mindst 2 cm, blev de overført til et rodningsmedium bestående af halvstyrke MS-medium, 0,5 mg/L indolsmørsyre (IBA) og 0,3% guargummi. Rodningskulturen fortsatte i tre uger, i hvilken periode rodningshastighed, antal rodceller og rodlængde blev målt. Hver behandling blev gentaget tre gange med 10 eksplantater dyrket pr. replikat, hvilket gav cirka 30 eksplantater pr. behandling.
Plantehøjden blev målt i centimeter (cm) ved hjælp af en lineal, fra plantens bund til spidsen af det højeste blad. Rodlængden blev målt i millimeter (mm) umiddelbart efter forsigtig fjernelse af kimplanterne og fjernelse af vækstmediet. Antallet af knopper pr. eksplantat blev talt direkte på hver plante. Antallet af sorte pletter på bladene, kendt som knuder, blev målt visuelt. Disse sorte knuder menes at være kirtler, der indeholder hypericin eller oxidative pletter, og bruges som en fysiologisk indikator for plantens reaktion på behandling. Efter fjernelse af alt vækstmediet blev kimplanternes friske vægt målt ved hjælp af en elektronisk vægt med en nøjagtighed på milligram (mg).
Metoden til beregning af hastigheden for kallusdannelse er som følger: Efter dyrkning af eksplantater i et medium indeholdende forskellige vækstregulatorer (kinaser, 2,4-D og Fe3O4) i fire uger tælles antallet af eksplantater, der er i stand til at danne kallus. Formlen til beregning af hastigheden for kallusdannelse er som følger:
Hver behandling blev gentaget tre gange, med mindst 10 eksplantater undersøgt i hver gentagelse.
Regenereringshastigheden afspejler andelen af kallusvæv, der fuldfører knopdifferentieringsprocessen efter kallusdannelsesstadiet. Denne indikator viser kallusvævets evne til at transformere sig til differentieret væv og vokse til nye planteorganer.
Rodningskoefficienten er forholdet mellem antallet af grene, der er i stand til at slå rod, og det samlede antal grene. Denne indikator afspejler succesen med rodningsfasen, som er afgørende for mikroformering og planteformering, da god rodning hjælper kimplanterne med bedre at overleve under vækstforhold.
Hypericinforbindelser blev ekstraheret med 90% methanol. Halvtreds mg tørret plantemateriale blev tilsat til 1 ml methanol og sonikeret i 20 minutter ved 30 kHz i en ultralydsrenser (model A5120-3YJ) ved stuetemperatur i mørke. Efter sonikering blev prøven centrifugeret ved 6000 rpm i 15 minutter. Supernatanten blev opsamlet, og hypericins absorbans blev målt ved 592 nm ved hjælp af et Plus-3000 S spektrofotometer i henhold til metoden beskrevet af Conceiçao et al. [14].
De fleste behandlinger med plantevækstregulatorer (PGR'er) og jernoxid-nanopartikler (Fe₃O₄-NP'er) inducerede ikke dannelse af sorte knuder på regenererede skudblade. Der blev ikke observeret knuder i nogen af behandlingerne med 0,5 eller 1 mg/L 2,4-D, 0,5 eller 1 mg/L kinetin eller 1, 2 eller 4 mg/L jernoxid-nanopartikler. Nogle få kombinationer viste en lille stigning i knududvikling (men ikke statistisk signifikant) ved højere koncentrationer af kinetin og/eller jernoxid-nanopartikler, såsom kombinationen af 2,4-D (0,5-2 mg/L) med kinetin (1-1,5 mg/L) og jernoxid-nanopartikler (2-4 mg/L). Disse resultater er vist i figur 2. Sorte knuder repræsenterer hypericinrige kirtler, både naturligt forekommende og gavnlige. I denne undersøgelse var sorte knuder primært forbundet med brunfarvning af væv, hvilket indikerer et gunstigt miljø for akkumulering af hypericin. Behandling med 2,4-D, kinetin og Fe₃O₄ nanopartikler fremmede callusvækst, reducerede brunfarvning og øgede klorofylindholdet, hvilket tyder på forbedret metabolisk funktion og potentiel reduktion af oxidativ skade [37]. Denne undersøgelse evaluerede virkningerne af kinetin i kombination med 2,4-D og Fe₃O₄ nanopartikler på vækst og udvikling af perikoncallus (fig. 3a-g). Tidligere undersøgelser har vist, at Fe₃O₄ nanopartikler har svampedræbende og antimikrobielle aktiviteter [38, 39], og når de anvendes i kombination med plantevækstregulatorer, kan de stimulere planters forsvarsmekanismer og reducere cellulære stressindekser [18]. Selvom biosyntesen af sekundære metabolitter er genetisk reguleret, er deres faktiske udbytte stærkt afhængigt af miljøforhold. Metaboliske og morfologiske ændringer kan påvirke niveauerne af sekundære metabolitter ved at regulere ekspressionen af specifikke plantegener og reagere på miljøfaktorer. Derudover kan induktorer udløse aktiveringen af nye gener, som igen stimulerer enzymatisk aktivitet, hvilket i sidste ende aktiverer flere biosyntetiske veje og fører til dannelsen af sekundære metabolitter. Ydermere viste en anden undersøgelse, at reduktion af skygge øger sollyseksponeringen, hvorved dagtemperaturerne i *Hypericum perforatum*s naturlige habitat hæves, hvilket også bidrager til øget hypericinudbytte. Baseret på disse data undersøgte denne undersøgelse rollen af jern-nanopartikler som potentielle induktorer i vævskultur. Resultaterne viste, at disse nanopartikler kan aktivere gener involveret i hesperidinbiosyntese gennem enzymatisk stimulering, hvilket fører til øget akkumulering af denne forbindelse (fig. 2). Sammenlignet med planter, der vokser under naturlige forhold, kan det derfor argumenteres for, at produktionen af sådanne forbindelser in vivo også kan forbedres, når moderat stress kombineres med aktivering af gener involveret i biosyntesen af sekundære metabolitter. Kombinationsbehandlinger har generelt en positiv effekt på regenereringshastigheden, men i nogle tilfælde svækkes denne effekt. Det er værd at bemærke, at behandling med 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinase og forskellige koncentrationer uafhængigt og signifikant kunne øge regenereringshastigheden med 50,85% sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 4c). Disse resultater tyder på, at specifikke kombinationer af nanohormoner kan virke synergistisk for at fremme plantevækst og metabolitproduktion, hvilket er af stor betydning for vævskultur af lægeplanter. Palmer og Keller [50] viste, at 2,4-D-behandling uafhængigt kunne inducere callusdannelse i St. perforatum, mens tilsætning af kinase signifikant forbedrede callusdannelse og regenerering. Denne effekt skyldtes forbedringen af hormonbalancen og stimulering af celledeling. Bal et al. [51] fandt, at Fe₃O₄-NP-behandling uafhængigt kunne forbedre funktionen af antioxidantenzymer og derved fremme rodvækst i St. perforatum. Kulturmedier indeholdende Fe₃O₄ nanopartikler i koncentrationer på 0,5 mg/L, 1 mg/L og 1,5 mg/L forbedrede regenereringshastigheden af hørplanter [52]. Brugen af kinetin, 2,4-dichlorbenzothiazolinon og Fe₃O₄ nanopartikler forbedrede callus- og roddannelseshastighederne betydeligt. De potentielle bivirkninger ved at bruge disse hormoner til in vitro-regenerering skal dog overvejes. For eksempel kan langvarig eller højkoncentrationsbrug af 2,4-dichlorbenzothiazolinon eller kinetin resultere i somatisk klonal variation, oxidativ stress, unormal callusmorfologi eller vitrifikation. Derfor forudsiger en høj regenereringshastighed ikke nødvendigvis genetisk stabilitet. Alle regenererede planter bør vurderes ved hjælp af molekylære markører (f.eks. RAPD, ISSR, AFLP) eller cytogenetisk analyse for at bestemme deres homogenitet og lighed med in vivo-planter [53,54,55].
Denne undersøgelse viste for første gang, at den kombinerede brug af plantevækstregulatorer (2,4-D og kinetin) med Fe₃O₄ nanopartikler kan forbedre morfogenese og akkumulering af vigtige bioaktive metabolitter (herunder hypericin og hyperosid) i *Hypericum perforatum*. Det optimerede behandlingsregime (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NP'er) maksimerede ikke kun kallusdannelse, organogenese og udbytte af sekundære metabolitter, men demonstrerede også en mild inducerende effekt, der potentielt forbedrede plantens stresstolerance og medicinske værdi. Kombinationen af nanoteknologi og plantevævskultur giver en bæredygtig og effektiv platform for storskala in vitro-produktion af medicinske forbindelser. Disse resultater baner vejen for industrielle anvendelser og fremtidig forskning i molekylære mekanismer, doseringsoptimering og genetisk præcision, hvorved grundlæggende forskning i lægeplanter forbindes med praktisk bioteknologi.
Udsendelsestidspunkt: 12. dec. 2025