Shoot apical meristem (SAM) vækst er afgørende for stilk arkitektur. Plantehormonergibberelliner(GA'er) spiller nøgleroller i at koordinere plantevækst, men deres rolle i SAM er stadig dårligt forstået. Her udviklede vi en ratiometrisk biosensor af GA-signalering ved at konstruere DELLA-proteinet til at undertrykke dets essentielle regulatoriske funktion i GA-transkriptionsresponset, mens dets nedbrydning ved GA-genkendelse bevares. Vi demonstrerer, at denne nedbrydningsbaserede biosensor nøjagtigt registrerer ændringer i GA-niveauer og cellulær sansning under udvikling. Vi brugte denne biosensor til at kortlægge GA-signaleringsaktivitet i SAM. Vi viser, at høje GA-signaler overvejende er til stede i celler placeret mellem organprimordia, som er forløbere for internodeceller. Ved hjælp af gain- og tab-of-function-tilgange demonstrerer vi yderligere, at GA regulerer orienteringen af celledelingsplanet og etablerer den kanoniske cellulære organisation af internoder og derved fremmer internodespecifikation i SAM.
Skudets apikale meristem (SAM), placeret ved skudspidsen, indeholder en niche af stamceller, hvis aktivitet genererer laterale organer og stængelknuder på en modulær og iterativ måde gennem hele plantens levetid. Hver af disse gentagne enheder eller planteknuder inkluderer internoder og laterale organer ved knuderne og aksillære meristemer i bladakserne1. Væksten og organiseringen af planteknuder ændres under udviklingen. I Arabidopsis undertrykkes internodal vækst i den vegetative fase, og aksillære meristemer forbliver i dvale i akserne på rosetblade. Under overgangen til blomsterfasen bliver SAM til blomsterstandens meristem, der genererer aflange internoder og aksillære knopper, grene i akserne på caulineblade og senere bladløse blomster2. Selvom vi har gjort betydelige fremskridt med at forstå de mekanismer, der styrer initieringen af blade, blomster og grene, ved man relativt lidt om, hvordan internoder opstår.
Forståelse af den spatiotemporale fordeling af GA'er vil hjælpe med bedre at forstå disse hormoners funktioner i forskellige væv og på forskellige udviklingsstadier. Visualisering af nedbrydningen af RGA-GFP-fusion udtrykt under påvirkning af dens egen promotor giver vigtig information om reguleringen af totale GA-niveauer i rødder15,16. Imidlertid varierer RGA-ekspression på tværs af væv17 og reguleres af GA18. Således kan differentiel ekspression af RGA-promotoren resultere i fluorescensmønsteret observeret med RGA-GFP, og denne metode er således ikke kvantitativ. For nylig afslørede bioaktivt fluorescein (Fl)-mærket GA19,20 akkumulering af GA i rodendocortex og reguleringen af dets cellulære niveauer ved GA-transport. For nylig viste GA FRET-sensoren nlsGPS1, at GA-niveauer korrelerer med celleforlængelse i rødder, filamenter og mørkvoksne hypocotyler21. Men som vi har set, er GA-koncentrationen ikke den eneste parameter, der styrer GA-signalaktiviteten, da den afhænger af komplekse registreringsprocesser. Her, der bygger på vores forståelse af DELLA- og GA-signalvejene, rapporterer vi udviklingen og karakteriseringen af en nedbrydningsbaseret ratiometrisk biosensor til GA-signalering. For at udvikle denne kvantitative biosensor brugte vi en mutant GA-følsom RGA, der blev fusioneret til et fluorescerende protein og allestedsnærværende udtrykt i væv, såvel som et GA-ufølsomt fluorescerende protein. Vi viser, at de mutante RGA-proteinfusioner ikke interfererer med endogen GA-signalering, når de udtrykkes allestedsnærværende, og at denne biosensor kan kvantificere signalaktivitet, der er et resultat af både GA-input og GA-signalbehandling af sanseapparatet med høj spatiotemporal opløsning. Vi brugte denne biosensor til at kortlægge den spatiotemporale fordeling af GA-signalaktivitet og kvantificere, hvordan GA regulerer cellulær adfærd i SAM-epidermis. Vi demonstrerer, at GA regulerer orienteringen af SAM-cellers divisionsplan, der er placeret mellem organprimordia, og derved definerer internodens kanoniske cellulære organisation.
Til sidst spurgte vi, om qmRGA kunne rapportere ændringer i endogene GA-niveauer ved hjælp af voksende hypocotyler. Vi har tidligere vist, at nitrat stimulerer vækst ved at øge GA-syntese og til gengæld DELLA34-nedbrydning. I overensstemmelse hermed observerede vi, at hypokotyllængden i pUBQ10::qmRGA frøplanter dyrket under rigelig nitratforsyning (10 mM NO3-) var signifikant længere end i frøplanter dyrket under nitratmangelfulde forhold (Supplerende Fig. 6a). I overensstemmelse med vækstresponset var GA-signaler højere i hypocotyler af frøplanter dyrket under 10 mM NO3−-betingelser end i frøplanter dyrket i fravær af nitrat (Supplerende Fig. 6b, c). Således muliggør qmRGA også overvågning af ændringer i GA-signalering induceret af endogene ændringer i GA-koncentration.
For at forstå, om GA-signalaktiviteten detekteret af qmRGA afhænger af GA-koncentration og GA-opfattelse, som forventet baseret på sensordesignet, analyserede vi ekspressionen af de tre GID1-receptorer i vegetativt og reproduktivt væv. I frøplanter viste GID1-GUS reporterlinjen, at GID1a og c var stærkt udtrykt i kimblade (fig. 3a-c). Derudover blev alle tre receptorer udtrykt i blade, lateral rod primordia, rodspidser (undtagen rodkappen af GID1b) og det vaskulære system (fig. 3a-c). I blomsterstanden SAM opdagede vi kun GUS-signaler for GID1b og 1c (Supplerende Fig. 7a-c). In situ hybridisering bekræftede disse ekspressionsmønstre og viste yderligere, at GID1c blev ensartet udtrykt ved lave niveauer i SAM, hvorimod GID1b viste højere ekspression i periferien af SAM (Supplerende Fig. 7d-l). Den translationelle pGID1b::2xmTQ2-GID1b-fusion afslørede også et graderet område af GID1b-ekspression, fra lav eller ingen ekspression i midten af SAM til høj ekspression ved organgrænserne (Supplerende Fig. 7m). GID1-receptorer er således ikke ensartet fordelt på tværs af og i væv. I efterfølgende eksperimenter observerede vi også, at overekspression af GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) øgede følsomheden af qmRGA i hypocotyler over for ekstern GA-påføring (fig. 3d, e). I modsætning hertil var fluorescens målt ved qd17mRGA i hypocotylen ufølsom over for GA3-behandling (fig. 3f, g). For begge analyser blev frøplanter behandlet med høje koncentrationer af GA (100 μM GA3) for at vurdere sensorens hurtige opførsel, hvor evnen til at binde til GID1-receptoren blev forbedret eller tabt. Tilsammen bekræfter disse resultater, at qmRGA-biosensoren tjener en kombineret funktion som en GA- og GA-sensor og antyder, at differentiel ekspression af GID1-receptoren signifikant kan modulere sensorens emissivitet.
Til dato er fordelingen af GA-signaler i SAM fortsat uklar. Derfor brugte vi qmRGA-udtrykkende planter og pCLV3::mCherry-NLS stamcelle-reporter35 til at beregne højopløselige kvantitative kort over GA-signalaktivitet med fokus på L1-laget (epidermis; Fig. 4a, b, se metoder og supplerende metoder), da L1 spiller en nøglerolle i SAM-vækst36. Her gav pCLV3::mCherry-NLS-ekspression et fast geometrisk referencepunkt til analyse af den spatiotemporale fordeling af GA-signalaktivitet37. Selvom GA anses for at være essentiel for lateral organudvikling4, observerede vi, at GA-signaler var lave i floral primordium (P) startende fra P3-stadiet (fig. 4a, b), hvorimod unge P1- og P2-primordier havde moderat aktivitet svarende til den i den centrale region (fig. 4a, b). Højere GA-signalaktivitet blev detekteret ved organets primordium-grænser, startende ved P1/P2 (ved siderne af grænsen) og toppede ved P4, såvel som i alle celler i den perifere region placeret mellem primordia (fig. 4a, b og supplerende fig. 8a, b). Denne højere GA-signalaktivitet blev observeret ikke kun i epidermis, men også i L2- og øvre L3-lag (Supplerende Fig. 8b). Mønstret af GA-signaler detekteret i SAM ved hjælp af qmRGA forblev også uændret over tid (Supplerende Fig. 8c-f, k). Selvom qd17mRGA-konstruktionen systematisk blev nedreguleret i SAM af T3-planter fra fem uafhængige linjer, som vi karakteriserede i detaljer, var vi i stand til at analysere fluorescensmønstrene opnået med pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruktionen (Supplerende Fig. 8g-j, l). I denne kontrollinje blev der kun påvist mindre ændringer i fluorescensforholdet i SAM, men i SAM-centret observerede vi et klart og uventet fald i VENUS forbundet med TagBFP. Dette bekræfter, at signalmønsteret observeret af qmRGA afspejler GA-afhængig nedbrydning af mRGA-VENUS, men viser også, at qmRGA kan overvurdere GA-signalaktivitet i meristemcentret. Sammenfattende afslører vores resultater et GA-signalmønster, der primært afspejler fordelingen af primordia. Denne fordeling af den interprimordiale region (IPR) skyldes den gradvise etablering af høj GA-signaleringsaktivitet mellem det udviklende primordium og det centrale område, mens GA-signaleringsaktiviteten i primordium samtidig falder (fig. 4c, d).
Fordelingen af GID1b- og GID1c-receptorer (se ovenfor) antyder, at differentiel ekspression af GA-receptorer hjælper med at forme mønsteret af GA-signalaktivitet i SAM. Vi spekulerede på, om differentiel akkumulering af GA kunne være involveret. For at undersøge denne mulighed brugte vi nlsGPS1 GA FRET sensor21. Øget aktiveringsfrekvens blev detekteret i SAM af nlsGPS1 behandlet med 10 μM GA4+7 i 100 min (Supplerende Fig. 9a-e), hvilket indikerer, at nlsGPS1 reagerer på ændringer i GA-koncentrationen i SAM, som det gør i roots21. Rumlig fordeling af nlsGPS1-aktiveringsfrekvens afslørede relativt lave GA-niveauer i de ydre lag af SAM, men viste, at de var forhøjet i midten og ved grænserne af SAM (fig. 4e og supplerende fig. 9a,c). Dette tyder på, at GA også er distribueret i SAM med et rumligt mønster, der kan sammenlignes med det, der afsløres af qmRGA. Som en komplementær tilgang behandlede vi også SAM med fluorescerende GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) eller Fl alene som en negativ kontrol. Fl-signalet blev fordelt over hele SAM, inklusive den centrale region og primordium, omend med en lavere intensitet (fig. 4j og supplerende fig. 10d). I modsætning hertil akkumulerede alle tre GA-Fl specifikt inden for primordium-grænserne og i varierende grad i resten af IPR, hvor GA7-Fl akkumulerede i det største domæne i IPR (fig. 4k og supplerende fig. 10a,b). Kvantificering af fluorescensintensitet afslørede, at IPR til ikke-IPR-intensitetsforholdet var højere i GA-Fl-behandlet SAM sammenlignet med Fl-behandlet SAM (fig. 41 og supplerende fig. 10c). Tilsammen tyder disse resultater på, at GA er til stede i højere koncentrationer i IPR-celler, der er placeret tættest på organgrænsen. Dette tyder på, at mønsteret af SAM GA-signalaktivitet er resultatet af både differentiel ekspression af GA-receptorer og differentiel akkumulering af GA i IPR-celler nær organgrænser. Således afslørede vores analyse et uventet spatiotemporalt mønster af GA-signalering med lavere aktivitet i midten og primordium af SAM og højere aktivitet i IPR i den perifere region.
For at forstå rollen af differentiel GA-signalaktivitet i SAM analyserede vi sammenhængen mellem GA-signaleringsaktivitet, celleudvidelse og celledeling ved hjælp af real-time time-lapse billeddannelse af SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. I betragtning af GA's rolle i vækstregulering forventedes en positiv korrelation med celleudvidelsesparametre. Derfor sammenlignede vi først GA-signalaktivitetskort med kort over celleoverfladevæksthastighed (som en proxy for styrken af celleudvidelse for en given celle og for datterceller ved deling) og med kort over vækstanisotropi, som måler retningsbestemt celleudvidelse (også brugt her for en given celle og for datterceller ved deling; Fig. 5a,b, se metoder og supplerende metoder). Vores kort over SAM-celleoverfladevæksthastighed er i overensstemmelse med tidligere observationer38,39, med minimal væksthastighed ved grænsen og maksimal væksthastighed i udviklende blomster (fig. 5a). Principal komponentanalyse (PCA) viste, at GA-signalaktivitet var negativt korreleret med celleoverfladevækstintensitet (figur 5c). Vi viste også, at de vigtigste variationsakser, herunder GA-signaleringsinput og vækstintensitet, var ortogonale i forhold til retningen bestemt af høj CLV3-ekspression, hvilket bekræfter udelukkelsen af celler fra SAM-centret i de resterende analyser. Spearman-korrelationsanalyse bekræftede PCA-resultaterne (figur 5d), hvilket indikerer, at højere GA-signaler i IPR ikke resulterede i højere celleudvidelse. Korrelationsanalyse afslørede imidlertid en let positiv korrelation mellem GA-signaleringsaktivitet og vækstanisotropi (figur 5c, d), hvilket tyder på, at højere GA-signalering i IPR påvirker retningen af cellevækst og muligvis positionen af celledelingsplanet.
a, b Varmekort over gennemsnitlig overfladevækst (a) og vækstanisotropi (b) i SAM i gennemsnit over syv uafhængige planter (anvendt som proxyer for henholdsvis styrken og retningen af celleudvidelse). c PCA-analyse inkluderede følgende variable: GA-signal, overfladevækstintensitet, overfladevækstanisotropi og CLV3-ekspression. PCA-komponent 1 var hovedsageligt negativt korreleret med overfladevækstintensitet og positivt korreleret med GA-signal. PCA-komponent 2 var hovedsageligt positivt korreleret med overfladevækstanisotropi og negativt korreleret med CLV3-ekspression. Procentsatser repræsenterer variationen forklaret af hver komponent. d Spearman-korrelationsanalyse mellem GA-signal, overfladevækstintensitet og overfladevækstanisotropi på vævsskalaen ekskl. CZ. Tallet til højre er Spearman rho værdien mellem to variable. Stjerner angiver tilfælde, hvor korrelationen/negative korrelation er meget signifikant. e 3D-visualisering af Col-0 SAM L1-celler ved konfokal mikroskopi. Nye cellevægge dannet i SAM (men ikke primordium) efter 10 timer farves i henhold til deres vinkelværdier. Farvelinjen vises i nederste højre hjørne. Indsatsen viser det tilsvarende 3D-billede ved 0 timer. Forsøget blev gentaget to gange med lignende resultater. f Boksplot viser celledelingshastigheder i IPR og ikke-IPR Col-0 SAM (n = 10 uafhængige planter). Midterlinjen viser medianen, og boksgrænserne angiver 25. og 75. percentilen. Whiskers angiver minimums- og maksimumværdierne bestemt med R-software. P-værdier blev opnået med Welchs to-halede t-test. g, h Skematisk diagram, der viser (g) hvordan man måler vinklen på den nye cellevæg (magenta) i forhold til den radiale retning fra midten af SAM (hvid stiplet linje) (kun spidse vinkelværdier, dvs. 0-90°, tages i betragtning), og (h) de periferiske/laterale og radiale retninger inden for meristem. i Frekvenshistogrammer af celledelingsplanorientering over henholdsvis SAM (mørkeblå), IPR (mellemblå) og ikke-IPR (lyseblå). P-værdier blev opnået ved en to-halet Kolmogorov-Smirnov-test. Forsøget blev gentaget to gange med lignende resultater. j Frekvenshistogrammer af celledelingsplanorientering af IPR omkring henholdsvis P3 (lysegrøn), P4 (mellemgrøn) og P5 (mørkegrøn). P-værdier blev opnået ved en to-halet Kolmogorov-Smirnov-test. Forsøget blev gentaget to gange med lignende resultater.
Derfor undersøgte vi derefter sammenhængen mellem GA-signalering og celledelingsaktivitet ved at identificere nydannede cellevægge under assayet (fig. 5e). Denne tilgang tillod os at måle frekvensen og retningen af celledeling. Overraskende fandt vi, at hyppigheden af celledelinger i IPR og resten af SAM (ikke-IPR, fig. 5f) var ens, hvilket indikerer, at forskelle i GA-signalering mellem IPR- og ikke-IPR-celler ikke signifikant påvirker celledeling. Dette, og den positive korrelation mellem GA-signalering og vækstanisotropi, fik os til at overveje, om GA-signalaktivitet kunne påvirke orienteringen af celledelingsplanet. Vi målte orienteringen af den nye cellevæg som en spids vinkel i forhold til den radiale akse, der forbinder meristemcentret og midten af den nye cellevæg (fig. 5e-i) og observerede en klar tendens til celler til at dele sig i vinkler tæt på 90° i forhold til den radiale akse, med de højeste frekvenser observeret ved 8°-20 %) og 0,8°-20% (8%). (22,62%) (fig. 5e,i), svarende til celledelinger i omkreds/tværgående retning (fig. 5h). For at undersøge bidraget fra GA-signalering til denne celledelingsadfærd analyserede vi celledelingsparametre i IPR og ikke-IPR separat (fig. 5i). Vi observerede, at fordelingen af delingsvinkel i IPR-celler adskilte sig fra den i ikke-IPR-celler eller i celler i hele SAM, hvor IPR-celler udviste en højere andel af laterale/cirkulære celledelinger, dvs. Vores observationer afslørede således en sammenhæng mellem høj GA-signalering og en celledelingsplanorientering tæt på periferretningen, svarende til korrelationen mellem GA-signaleringsaktivitet og vækstanisotropi (fig. 5c, d). For yderligere at etablere den rumlige bevarelse af denne forening målte vi delingsplanorienteringen i IPR-celler, der omgiver primordium startende fra P3, da den højeste GA-signalaktivitet blev detekteret i denne region startende fra P4 (fig. 4). Delingsvinklerne for IPR omkring P3 og P4 viste ingen statistisk signifikante forskelle, selvom en øget frekvens af laterale celledelinger blev observeret i IPR omkring P4 (fig. 5j). I IPR-cellerne omkring P5 blev forskellen i orienteringen af celledelingsplanet imidlertid statistisk signifikant med en kraftig stigning i frekvensen af tværgående celledelinger (fig. 5j). Sammen tyder disse resultater på, at GA-signalering kan kontrollere orienteringen af celledelinger i SAM, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter40,41, at høj GA-signalering kan inducere lateral orientering af celledelinger i IPR.
Det forudsiges, at celler i IPR ikke vil blive inkorporeret i primordia, men snarere i internoder2,42,43. Den tværgående orientering af celledelinger i IPR kan resultere i den typiske organisering af parallelle langsgående rækker af epidermale celler i internoder. Vores observationer beskrevet ovenfor tyder på, at GA-signalering sandsynligvis spiller en rolle i denne proces ved at regulere retningen af celledeling.
Tab af funktion af flere DELLA-gener resulterer i et konstitutivt GA-respons, og della-mutanter kan bruges til at teste denne hypotese44. Vi analyserede først ekspressionsmønstrene for fem DELLA-gener i SAM. Transkriptionel fusion af GUS-linjen45 afslørede, at GAI, RGA, RGL1 og RGL2 (i meget mindre grad) blev udtrykt i SAM (Supplerende Fig. 11a-d). In situ hybridisering viste yderligere, at GAI mRNA akkumuleres specifikt i primordia og udviklende blomster (Supplerende Fig. 11e). RGL1 og RGL3 mRNA blev påvist i hele SAM baldakinen og i ældre blomster, hvorimod RGL2 mRNA var mere rigeligt i grænseregionen (Supplerende Fig. 11f-h). Konfokal billeddannelse af pRGL3::RGL3-GFP SAM bekræftede ekspressionen observeret ved in situ hybridisering og viste, at RGL3-protein akkumuleres i den centrale del af SAM'et (Supplerende Fig. 11i). Ved at bruge pRGA::GFP-RGA-linjen fandt vi også, at RGA-protein akkumuleres i SAM, men dets overflod falder ved grænsen startende fra P4 (Supplerende Fig. 11j). Især er ekspressionsmønstrene for RGL3 og RGA i overensstemmelse med højere GA-signaleringsaktivitet i IPR, som påvist af qmRGA (fig. 4). Desuden indikerer disse data, at alle DELLA'er er udtrykt i SAM, og at deres udtryk tilsammen spænder over hele SAM.
Vi analyserede derefter celledelingsparametrene i vildtype-SAM (Ler, kontrol) og gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della femdobbelte (globale) mutanter (fig. 6a, b). Interessant nok observerede vi et statistisk signifikant skift i fordelingen af celledelingsvinkelfrekvenser i della global mutant SAM sammenlignet med vildtypen (fig. 6c). Denne ændring i della global mutant skyldtes en stigning i frekvensen af 80-90° vinkler (34,71% vs. 24,55%) og, i mindre grad, 70-80° vinkler (23,78% vs. 20,18%), dvs. svarende til tværgående celledelinger (Fig. 6c). Hyppigheden af ikke-tværgående divisioner (0-60°) var også lavere i della global mutant (fig. 6c). Hyppigheden af tværgående celledelinger var signifikant forøget i SAM af den della globale mutant (fig. 6b). Hyppigheden af tværgående celledelinger i IPR var også højere i della global mutant sammenlignet med vildtypen (fig. 6d). Uden for IPR-regionen havde vildtypen en mere ensartet fordeling af celledelingsvinkler, hvorimod della global mutant foretrak tangentielle divisioner som IPR (fig. 6e). Vi kvantificerede også orienteringen af celledelinger i SAM af ga2 oxidase (ga2ox) femdobbelte mutanter (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 og ga2ox6-2), en GA-inaktiv mutant baggrund, hvor GA akkumuleres. I overensstemmelse med stigningen i GA-niveauer var SAM af den femdobbelte ga2ox mutantblomsterstand større end den for Col-0 (Supplerende Fig. 12a, b), og sammenlignet med Col-0 viste den femdobbelte ga2ox SAM en tydeligt anderledes fordeling af celledelingsvinkler, med vinkelfrekvensen 500° tangerende til igen 9,° inddelinger (Supplerende Fig. 12a–c). Således viser vi, at konstitutiv aktivering af GA-signalering og GA-akkumulering inducerer laterale celledelinger i IPR og resten af SAM.
a, b 3D-visualisering af L1-laget af PI-farvet Ler (a) og global della mutant (b) SAM ved hjælp af konfokal mikroskopi. Nye cellevægge dannet i SAM (men ikke primordium) over en 10-timers periode vises og farves i henhold til deres vinkelværdier. Indsatsen viser SAM ved 0 h. Farvebjælken vises i nederste højre hjørne. Pilen i (b) peger på et eksempel på tilpassede cellefiler i den globale della-mutant. Forsøget blev gentaget to gange med lignende resultater. ce sammenligning af frekvensfordelingen af celledelingsplanorienteringer i hele SAM (d), IPR (e) og ikke-IPR (f) mellem Ler og global della. P-værdier blev opnået ved hjælp af en to-halet Kolmogorov-Smirnov-test. f, g 3D-visualisering af konfokale billeder af PI-farvede SAM af Col-0 (i) og pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgene planter. Paneler (a, b) viser nye cellevægge (men ikke primordia) dannet i SAM inden for 10 timer. Forsøget blev gentaget to gange med lignende resultater. h–j Sammenligning af frekvensfordelingen af celledelingsplanorienteringer placeret i hele SAM (h), IPR (i) og ikke-IPR (j) mellem Col-0 og pCUC2::gai-1-VENUS planter. P-værdier blev opnået ved hjælp af en to-halet Kolmogorov-Smirnov-test.
Vi testede derefter effekten af at hæmme GA-signalering specifikt i IPR. Til dette formål brugte vi cotyledon cup 2 (CUC2)-promotoren til at drive ekspression af et dominant negativt gai-1-protein fusioneret til VENUS (i pCUC2::gai-1-VENUS-linjen). I vildtype-SAM driver CUC2-promotoren ekspression af de fleste IPR'er i SAM, inklusive grænseceller, fra P4 og fremefter, og lignende specifik ekspression blev observeret i pCUC2::gai-1-VENUS-planter (se nedenfor). Fordelingen af celledelingsvinkler på tværs af SAM eller IPR af pCUC2::gai-1-VENUS planter var ikke signifikant forskellig fra vildtypens, selvom vi uventet fandt, at celler uden en IPR i disse planter delte sig med en højere frekvens på 80-90° (fig. 6f-j).
Det er blevet foreslået, at retningen af celledeling afhænger af geometrien af SAM, især trækspændingen genereret af vævskrumningen46. Vi spurgte derfor, om formen af SAM var ændret i della global mutant og pCUC2::gai-1-VENUS planter. Som tidligere rapporteret12 var størrelsen af den della globale mutant SAM større end vildtypens størrelse (Supplerende Fig. 13a, b, d). In situ hybridisering af CLV3 og STM RNA bekræftede meristemudvidelsen i della mutanter og viste yderligere den laterale ekspansion af stamcellenichen (Supplerende Fig. 13e, f, h, i). Imidlertid var SAM-kurvaturen ens i begge genotyper (Supplerende Fig. 13k, m, n, p). Vi observerede en lignende stigning i størrelse i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della firdobbelt mutant uden en ændring i krumning sammenlignet med vildtypen (Supplerende Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Hyppigheden af celledelingsorientering blev også påvirket i den della firdobbelte mutant, men i mindre grad end i den della monolitiske mutant (Supplerende Fig. 12d-f). Denne doseringseffekt, sammen med manglen på en effekt på krumning, tyder på, at resterende RGL3-aktivitet i Della-firedoblet mutant begrænser ændringer i celledelingsorientering forårsaget af tab af DELLA-aktivitet, og at ændringer i laterale celledelinger opstår som reaktion på ændringer i GA-signalaktivitet snarere end ændringer i SAM-geometri. Som beskrevet ovenfor driver CUC2-promotoren IPR-ekspression i SAM startende ved P4 (Supplerende Fig. 14a, b), og i modsætning hertil havde pCUC2::gai-1-VENUS SAM en reduceret størrelse, men højere krumning (Supplerende Fig. 14c-h). Denne ændring i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologi kan resultere i en anden fordeling af mekaniske spændinger sammenlignet med vildtypen, hvor høje periferiske spændinger starter i en kortere afstand fra SAM-centret47. Alternativt kan ændringerne i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologi skyldes ændringer i regionale mekaniske egenskaber induceret af transgenekspression48. I begge tilfælde kunne dette delvist opveje virkningerne af ændringer i GA-signalering ved at øge sandsynligheden for, at celler deler sig i den periferiske/tværgående orientering, hvilket forklarer vores observationer.
Samlet bekræfter vores data, at højere GA-signalering spiller en aktiv rolle i den laterale orientering af celledelingsplanet i IPR. De viser også, at meristem-krumning også påvirker orienteringen af celledelingsplanet i IPR.
Den tværgående orientering af divisionsplanet i IPR, på grund af høj GA-signaleringsaktivitet, tyder på, at GA fororganiserer en radial cellefil i epidermis inden for SAM for at definere den cellulære organisation, som senere vil blive fundet i den epidermale internode. Sådanne cellefiler var faktisk ofte synlige i SAM-billeder af della globale mutanter (fig. 6b). For yderligere at udforske udviklingsfunktionen af det rumlige mønster af GA-signalering i SAM brugte vi time-lapse billeddannelse til at analysere den rumlige organisering af celler i IPR i vildtype (Ler og Col-0), della globale mutanter og pCUC2::gai-1-VENUS transgene planter.
Vi fandt ud af, at qmRGA viste, at GA-signaleringsaktivitet i IPR steg fra P1/P2 og toppede ved P4, og dette mønster forblev konstant over tid (fig. 4a-f og supplerende fig. 8c-f, k). For at analysere den rumlige organisering af celler i IPR med stigende GA-signal, mærkede vi Ler IPR-celler over og til siderne af P4 i henhold til deres udviklingsskæbne analyseret 34 timer efter første observation, dvs. mere end to plastidtider, hvilket giver os mulighed for at følge IPR-celler under primordium-udvikling fra P1/P2 til P4. Vi brugte tre forskellige farver: gul for de celler, der var integreret i primordium nær P4, grøn for dem, der var i IPR, og lilla for dem, der deltog i begge processer (fig. 7a-c). Ved t0 (0 timer) var 1-2 lag IPR-celler synlige foran P4 (fig. 7a). Som forventet, når disse celler delte sig, gjorde de det hovedsageligt via tværdelingsplanet (fig. 7a-c). Lignende resultater blev opnået ved anvendelse af Col-0 SAM (med fokus på P3, hvis kantfoldninger svarer til P4 i Ler), selvom folden dannet ved blomsterkanten i denne genotype skjulte IPR-cellerne hurtigere (fig. 7g-i). Delingsmønsteret af IPR-celler fororganiserer således cellerne i radiale rækker, som i internoder. Organiseringen af radiale rækker og lokaliseringen af IPR-celler mellem på hinanden følgende organer tyder på, at disse celler er internodale progenitorer.
Her udviklede vi en ratiometrisk GA-signaleringsbiosensor, qmRGA, der tillader kvantitativ kortlægning af GA-signalaktivitet som følge af kombinerede GA- og GA-receptorkoncentrationer, mens interferens med endogene signalveje minimeres, og derved giver information om GA-funktion på cellulært niveau. Til dette formål konstruerede vi et modificeret DELLA-protein, mRGA, der har mistet evnen til at binde DELLA-interaktionspartnere, men forbliver følsomt over for GA-induceret proteolyse. qmRGA reagerer på både eksogene og endogene ændringer i GA-niveauer, og dets dynamiske sanseegenskaber muliggør vurdering af rumlige ændringer i GA-signalaktivitet under udvikling. qmRGA er også et meget fleksibelt værktøj, da det kan tilpasses forskellige væv ved at ændre promotoren, der bruges til dets ekspression (hvis nødvendigt), og i betragtning af den bevarede natur af GA-signalvejen og PFYRE-motivet på tværs af angiospermer, vil det sandsynligvis være overførbart til andre arter22. I overensstemmelse med dette blev en ækvivalent mutation i ris SLR1 DELLA-proteinet (HYY497AAA) også vist at undertrykke vækstrepressoraktiviteten af SLR1, mens den kun reducerede dets GA-medierede nedbrydning, svarende til mRGA23. Nylige undersøgelser i Arabidopsis viste især, at en enkelt aminosyremutation i PFYRE-domænet (S474L) ændrede RGA's transkriptionelle aktivitet uden at påvirke dets evne til at interagere med transkriptionsfaktorpartnere50. Selvom denne mutation er meget tæt på de 3 aminosyresubstitutioner, der er til stede i mRGA, viser vores undersøgelser, at disse to mutationer ændrer forskellige karakteristika for DELLA. Selvom de fleste transkriptionsfaktorpartnere binder til LHR1- og SAW-domænerne af DELLA26,51, kan nogle konserverede aminosyrer i PFYRE-domænet hjælpe med at stabilisere disse interaktioner.
Internodeudvikling er en nøgleegenskab i plantearkitektur og udbytteforbedring. qmRGA afslørede højere GA-signaleringsaktivitet i IPR internode progenitorceller. Ved at kombinere kvantitativ billeddannelse og genetik viste vi, at GA-signalmønstre overlejrer cirkulære/tværgående celledelingsplaner i SAM-epidermis, hvilket former den celledelingsorganisation, der kræves til internodeudvikling. Adskillige regulatorer af celledelingsplanorientering er blevet identificeret under udvikling52,53. Vores arbejde giver et klart eksempel på, hvordan GA-signalaktivitet regulerer denne cellulære parameter. DELLA kan interagere med præfoldende proteinkomplekser41, så GA-signalering kan regulere celledelingsplanorienteringen ved direkte at påvirke kortikale mikrotubulus orientering40,41,54,55. Vi viste uventet, at i SAM var korrelatet mellem højere GA-signaleringsaktivitet ikke celleforlængelse eller -deling, men kun vækstanisotropi, hvilket er i overensstemmelse med en direkte effekt af GA på retningen af celledeling i IPR. Vi kan dog ikke udelukke, at denne effekt også kan være indirekte, for eksempel medieret af GA-induceret cellevægsblødgøring56. Ændringer i cellevæggenskaber inducerer mekanisk stress57,58, som også kan påvirke orienteringen af celledelingsplanet ved at påvirke orienteringen af kortikale mikrotubuli39,46,59. De kombinerede virkninger af GA-induceret mekanisk stress og direkte regulering af mikrotubulus orientering af GA kan være involveret i at generere et specifikt mønster af celledelingsorientering i IPR for at definere internoder, og yderligere undersøgelser er nødvendige for at teste denne idé. Tilsvarende har tidligere undersøgelser fremhævet vigtigheden af de DELLA-interagerende proteiner TCP14 og 15 i kontrollen af internodedannelse60,61, og disse faktorer kan mediere virkningen af GA sammen med BREVIPEDICELLUS (BP) og PENNYWISE (PNY), som regulerer internodeudvikling og har vist sig at påvirke,62GA-signalering2. I betragtning af at DELLA'er interagerer med brassinosteroid, ethylen, jasmonsyre og abscisinsyre (ABA) signalveje63,64 og at disse hormoner kan påvirke mikrotubulus orientering65, kan virkningerne af GA på celledelingsorientering også medieres af andre hormoner.
Tidlige cytologiske undersøgelser viste, at både de indre og ydre regioner af Arabidopsis SAM er nødvendige for internodeudvikling2,42. Det faktum, at GA aktivt regulerer celledeling i de indre væv12, understøtter en dobbeltfunktion af GA til regulering af meristem og internodestørrelse i SAM. Mønstret for retningsbestemt celledeling er også stramt reguleret i det indre SAM-væv, og denne regulering er afgørende for stamvækst52. Det vil være interessant at undersøge, om GA også spiller en rolle i at orientere celledelingsplanet i den indre SAM-organisation og derved synkronisere specifikationen og udviklingen af internoder indenfor SAM.
Planter blev dyrket in vitro i jord eller 1 x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) suppleret med 1% saccharose og 1% agar (Sigma) under standardbetingelser (16 timers lys, 22 °C), bortset fra hypocotyl- og rodvækstforsøg, hvor frøplanter blev dyrket på lodrette plader under konstant lys og 22 °C. Til nitratforsøg blev planter dyrket på modificeret MS-medium (bioWORLD-plantemedium) suppleret med tilstrækkeligt nitrat (0 eller 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinat, 1 % saccharose og 1 % A-agar (Sigma) under langdagsbetingelser.
GID1a cDNA indsat i pDONR221 blev rekombineret med pDONR P4-P1R-pUBQ10 og pDONR P2R-P3-mCherry i pB7m34GW for at generere pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA indsat i pDONR221 blev rekombineret i pB7RWG266 for at generere p35S:IDD2-RFP. For at generere pGID1b::2xmTQ2-GID1b blev et 3,9 kb fragment opstrøms for den GID1b kodende region og et 4,7 kb fragment indeholdende GID1b cDNA'et (1,3 kb) og terminatoren (3,4 kb) først amplificeret under anvendelse af primerne i Supplerende Tabel 43 og derefter i PNR-tabel 43. Fisher Scientific) og pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), og til sidst rekombineret med pDONR221 2xmTQ268 i pGreen 012567 målvektoren ved hjælp af Gateway-kloning. For at generere pCUC2::LSSmOrange blev CUC2-promotorsekvensen (3229 bp opstrøms for ATG) efterfulgt af den kodende sekvens af stor Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 med N7-kernelokaliseringssignalet og NOS-transkriptionsterminatoren samlet i pGreen-recomway-målvektoren kanamybin-recomway-målvektoren-kanamybin-systemet. (Invitrogen). Den binære plantevektor blev indført i Agrobacterium tumefaciens-stamme GV3101 og indført i Nicotiana benthamiana-blade ved henholdsvis Agrobacterium-infiltrationsmetoden og i Arabidopsis thaliana Col-0 ved floral dip-metoden. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry og pCLV3::mCherry-NLS qmRGA blev isoleret fra henholdsvis F3- og F1-afkom af de respektive krydsninger.
RNA in situ-hybridisering blev udført på ca. 1 cm lange skudspidser72, som blev opsamlet og straks fikseret i FAA-opløsning (3,7 % formaldehyd, 5 % eddikesyre, 50 % ethanol) forkølet til 4 °C. Efter 2 x 15 minutters vakuumbehandlinger blev fikseringsmidlet skiftet, og prøverne blev inkuberet natten over. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 og RGL3 cDNA'er og antisense-prober til deres 3'-UTR'er blev syntetiseret under anvendelse af primerne vist i supplerende tabel 3 som beskrevet af Rosier et al.73. Digoxigenin-mærkede prober blev immundetekteret ved hjælp af digoxigenin-antistoffer (3000-fold fortynding; Roche, katalognummer: 11 093 274 910), og sektioner blev farvet med 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP, 250-fold diluet-BT, 250-fold diluet (N) 200 gange fortynding) opløsning.
Indlægstid: 10-feb-2025