Vækst af skudspidsmeristem (SAM) er afgørende for stængelarkitekturen. Plantehormonergibberelliner(GA'er) spiller en nøglerolle i koordineringen af plantevækst, men deres rolle i SAM er fortsat dårligt forstået. Her udviklede vi en ratiometrisk biosensor af GA-signalering ved at konstruere DELLA-proteinet til at undertrykke dets essentielle regulatoriske funktion i GA's transkriptionelle respons, samtidig med at dets nedbrydning ved GA-genkendelse bevares. Vi demonstrerer, at denne nedbrydningsbaserede biosensor nøjagtigt registrerer ændringer i GA-niveauer og cellulær registrering under udvikling. Vi brugte denne biosensor til at kortlægge GA-signaleringsaktivitet i SAM. Vi viser, at høje GA-signaler overvejende er til stede i celler placeret mellem organprimordier, som er forstadier til internodeceller. Ved hjælp af gain- og loss-of-function-tilgange demonstrerer vi yderligere, at GA regulerer orienteringen af celledelingsplanet, etablerer den kanoniske cellulære organisering af internoder og derved fremmer internodespecifikation i SAM.
Skuddets apikale meristem (SAM), der er placeret ved skudspidsen, indeholder en niche af stamceller, hvis aktivitet genererer laterale organer og stængelknuder på en modulær og iterativ måde gennem hele plantens levetid. Hver af disse gentagne enheder, eller plantenknuder, inkluderer internoder og laterale organer ved knuderne samt aksillære meristemer i bladhjørnerne1. Væksten og organiseringen af plantenknuder ændrer sig under udviklingen. I Arabidopsis undertrykkes internodal vækst i den vegetative fase, og aksillære meristemer forbliver inaktive i rosetbladenes hjørner. Under overgangen til blomsterfasen bliver SAM til blomsterstandsmeristem, der genererer aflange internoder og aksillære knopper, smågrene i hjørner af blomstblade og senere bladløse blomster2. Selvom vi har gjort betydelige fremskridt med at forstå de mekanismer, der styrer initieringen af blade, blomster og grene, vides der relativt lidt om, hvordan internoder opstår.
Forståelse af den spatiotemporale fordeling af GA'er vil bidrage til bedre at forstå disse hormoners funktioner i forskellige væv og på forskellige udviklingsstadier. Visualisering af nedbrydningen af RGA-GFP-fusion udtrykt under påvirkning af sin egen promotor giver vigtig information om reguleringen af totale GA-niveauer i rødder15,16. RGA-ekspression varierer dog på tværs af væv17 og reguleres af GA18. Således kan differentiel ekspression af RGA-promotoren resultere i det fluorescensmønster, der observeres med RGA-GFP, og derfor er denne metode ikke kvantitativ. For nylig afslørede bioaktivt fluorescein (Fl)-mærket GA19,20 akkumulering af GA i rodens endokortex og reguleringen af dets cellulære niveauer ved GA-transport. For nylig viste GA FRET-sensoren nlsGPS1, at GA-niveauer korrelerer med celleforlængelse i rødder, filamenter og mørkvoksne hypokotyler21. Som vi har set, er GA-koncentration imidlertid ikke den eneste parameter, der kontrollerer GA-signalaktivitet, da den afhænger af komplekse registreringsprocesser. Her, baseret på vores forståelse af DELLA- og GA-signalvejene, rapporterer vi udviklingen og karakteriseringen af en nedbrydningsbaseret ratiometrisk biosensor til GA-signalering. For at udvikle denne kvantitative biosensor anvendte vi en mutant GA-følsom RGA, der var fusioneret til et fluorescerende protein og ubikvitært udtrykt i væv, såvel som et GA-ufølsomt fluorescerende protein. Vi viser, at de mutante RGA-proteinfusioner ikke interfererer med endogen GA-signalering, når de udtrykkes ubikvitært, og at denne biosensor kan kvantificere signalaktivitet som følge af både GA-input og GA-signalbehandling af sensorapparatet med høj spatiotemporal opløsning. Vi brugte denne biosensor til at kortlægge den spatiotemporale fordeling af GA-signalaktivitet og kvantificere, hvordan GA regulerer cellulær adfærd i SAM-epidermis. Vi demonstrerer, at GA regulerer orienteringen af delingsplanet for SAM-celler placeret mellem organprimordier og derved definerer den kanoniske cellulære organisation af internoden.
Endelig spurgte vi, om qmRGA kunne rapportere ændringer i endogene GA-niveauer ved hjælp af voksende hypokotyler. Vi har tidligere vist, at nitrat stimulerer vækst ved at øge GA-syntesen og dermed DELLA34-nedbrydningen. Følgelig observerede vi, at hypokotyllængden i pUBQ10::qmRGA-kimplanter dyrket under rigelig nitratforsyning (10 mM NO3−) var signifikant længere end i kimplanter dyrket under nitratfattige forhold (Supplerende Fig. 6a). I overensstemmelse med vækstresponset var GA-signaler højere i hypokotyler af kimplanter dyrket under 10 mM NO3−-forhold end i kimplanter dyrket i fravær af nitrat (Supplerende Fig. 6b, c). Således muliggør qmRGA også overvågning af ændringer i GA-signalering induceret af endogene ændringer i GA-koncentration.
For at forstå, om den GA-signalaktivitet, der detekteres af qmRGA, afhænger af GA-koncentration og GA-opfattelse, som forventet baseret på sensordesignet, analyserede vi ekspressionen af de tre GID1-receptorer i vegetative og reproduktive væv. I kimplanter viste GID1-GUS-reporterlinjen, at GID1a og c var højt udtrykt i kimblade (fig. 3a-c). Derudover blev alle tre receptorer udtrykt i blade, laterale rodprimordier, rodspidser (undtagen rodhatten på GID1b) og det vaskulære system (fig. 3a-c). I blomsterstandens SAM detekterede vi kun GUS-signaler for GID1b og 1c (supplerende fig. 7a-c). In situ-hybridisering bekræftede disse ekspressionsmønstre og demonstrerede yderligere, at GID1c blev udtrykt ensartet på lave niveauer i SAM, hvorimod GID1b viste højere ekspression i periferien af SAM (supplerende fig. 7d-l). Den translationelle fusion pGID1b::2xmTQ2-GID1b afslørede også et graderet interval af GID1b-ekspression, fra lav eller ingen ekspression i midten af SAM til høj ekspression ved organgrænserne (Supplerende figur 7m). GID1-receptorer er således ikke ensartet fordelt på tværs af og i væv. I efterfølgende eksperimenter observerede vi også, at overekspression af GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) øgede følsomheden af qmRGA i hypokotyler over for ekstern GA-applikation (figur 3d, e). I modsætning hertil var fluorescens målt ved qd17mRGA i hypokotylen ufølsom over for GA3-behandling (figur 3f, g). For begge assays blev kimplanter behandlet med høje koncentrationer af GA (100 μM GA3) for at vurdere sensorens hurtige opførsel, hvor evnen til at binde til GID1-receptoren var forbedret eller tabt. Samlet set bekræfter disse resultater, at qmRGA-biosensoren tjener en kombineret funktion som en GA- og GA-sensor, og antyder, at differentiel ekspression af GID1-receptoren kan modulere sensorens emissivitet betydeligt.
Fordelingen af GA-signaler i SAM er til dato stadig uklar. Derfor brugte vi qmRGA-udtrykkende planter og pCLV3::mCherry-NLS stamcelle-reporteren35 til at beregne kvantitative kort med høj opløsning over GA-signalaktivitet med fokus på L1-laget (epidermis; fig. 4a, b, se Metoder og Supplerende Metoder), da L1 spiller en nøglerolle i at kontrollere SAM-vækst36. Her gav pCLV3::mCherry-NLS-ekspression et fast geometrisk referencepunkt til analyse af den spatiotemporale fordeling af GA-signalaktivitet37. Selvom GA anses for essentielt for lateral organudvikling4, observerede vi, at GA-signalerne var lave i blomsterprimordiet (P) startende fra P3-stadiet (fig. 4a, b), hvorimod unge P1- og P2-primordier havde moderat aktivitet svarende til den i den centrale region (fig. 4a, b). Højere GA-signalaktivitet blev detekteret ved organets primordiumgrænser, startende ved P1/P2 (på siderne af grænsen) og med en top ved P4, såvel som i alle celler i den perifere region placeret mellem primordia (fig. 4a, b og supplerende fig. 8a, b). Denne højere GA-signalaktivitet blev observeret ikke kun i epidermis, men også i L2- og øvre L3-lag (supplerende fig. 8b). Mønsteret af GA-signaler detekteret i SAM ved hjælp af qmRGA forblev også uændret over tid (supplerende fig. 8c-f, k). Selvom qd17mRGA-konstruktionen systematisk blev nedreguleret i SAM af T3-planter fra fem uafhængige linjer, som vi karakteriserede i detaljer, var vi i stand til at analysere de fluorescensmønstre, der blev opnået med pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruktionen (supplerende fig. 8g-j, l). I denne kontrollinje blev der kun detekteret mindre ændringer i fluorescensforholdet i SAM, men i SAM-centret observerede vi et klart og uventet fald i VENUS associeret med TagBFP. Dette bekræfter, at signalmønsteret observeret af qmRGA afspejler GA-afhængig nedbrydning af mRGA-VENUS, men demonstrerer også, at qmRGA muligvis overvurderer GA-signalaktiviteten i meristemcentret. Sammenfattende afslører vores resultater et GA-signalmønster, der primært afspejler fordelingen af primordier. Denne fordeling af den inter-primordiale region (IPR) skyldes den gradvise etablering af høj GA-signalaktivitet mellem det udviklende primordium og den centrale region, samtidig med at GA-signalaktiviteten i primordium falder (fig. 4c, d).
Fordelingen af GID1b- og GID1c-receptorer (se ovenfor) antyder, at differentiel ekspression af GA-receptorer er med til at forme mønsteret af GA-signalaktivitet i SAM. Vi spekulerede på, om differentiel akkumulering af GA kunne være involveret. For at undersøge denne mulighed brugte vi nlsGPS1 GA FRET-sensoren21. Øget aktiveringsfrekvens blev detekteret i SAM af nlsGPS1 behandlet med 10 μM GA4+7 i 100 minutter (supplerende figur 9a-e), hvilket indikerer, at nlsGPS1 reagerer på ændringer i GA-koncentrationen i SAM, ligesom det gør i rødder21. Rumlig fordeling af nlsGPS1-aktiveringsfrekvens afslørede relativt lave GA-niveauer i de ydre lag af SAM, men viste, at de var forhøjede i midten og ved SAM's grænser (figur 4e og supplerende figur 9a,c). Dette antyder, at GA også er fordelt i SAM med et rumligt mønster, der kan sammenlignes med det, der afsløres af qmRGA. Som en supplerende tilgang behandlede vi også SAM med fluorescerende GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) eller Fl alene som en negativ kontrol. Fl-signalet var fordelt i hele SAM, inklusive den centrale region og primordium, omend med en lavere intensitet (fig. 4j og supplerende fig. 10d). I modsætning hertil akkumulerede alle tre GA-Fl specifikt inden for primordiumgrænserne og i varierende grad i resten af IPR, hvor GA7-Fl akkumulerede i det største domæne i IPR (fig. 4k og supplerende fig. 10a,b). Kvantificering af fluorescensintensitet viste, at forholdet mellem IPR og ikke-IPR-intensitet var højere i GA-Fl-behandlet SAM sammenlignet med Fl-behandlet SAM (fig. 4l og supplerende fig. 10c). Samlet set tyder disse resultater på, at GA er til stede i højere koncentrationer i IPR-celler, der er placeret tættest på organgrænsen. Dette tyder på, at mønsteret af SAM GA-signalaktivitet skyldes både differentiel ekspression af GA-receptorer og differentiel akkumulering af GA i IPR-celler nær organgrænser. Vores analyse afslørede således et uventet spatiotemporalt mønster af GA-signalering med lavere aktivitet i SAM's centrum og primordium og højere aktivitet i IPR i den perifere region.
For at forstå rollen af differentiel GA-signalaktivitet i SAM analyserede vi korrelationen mellem GA-signalaktivitet, celleekspansion og celledeling ved hjælp af realtids-timelapse-billeddannelse af SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. I betragtning af GA's rolle i vækstregulering forventedes en positiv korrelation med celleekspansionsparametre. Derfor sammenlignede vi først GA-signalaktivitetskort med kort over celleoverfladevækstrate (som en proxy for styrken af celleekspansion for en given celle og for datterceller ved deling) og med kort over vækstanisotropi, som måler retningen af celleekspansion (også brugt her for en given celle og for datterceller ved deling; Fig. 5a,b, se Metoder og Supplerende Metoder). Vores kort over SAM-celleoverfladevækstrate er i overensstemmelse med tidligere observationer38,39, med minimale vækstrater ved grænsen og maksimale vækstrater i udviklende blomster (Fig. 5a). Principal component analysis (PCA) viste, at GA-signalaktivitet var negativt korreleret med celleoverfladevækstrateintensitet (Figur 5c). Vi viste også, at de vigtigste variationsakser, herunder GA-signalinput og vækstintensitet, var ortogonale i forhold til den retning, der bestemmes af høj CLV3-ekspression, hvilket bekræfter udelukkelsen af celler fra SAM-centret i de resterende analyser. Spearman-korrelationsanalyse bekræftede PCA-resultaterne (Figur 5d), hvilket indikerer, at højere GA-signaler i IPR ikke resulterede i højere celleekspansion. Korrelationsanalyse afslørede imidlertid en lille positiv korrelation mellem GA-signalaktivitet og vækstanisotropi (Figur 5c, d), hvilket tyder på, at højere GA-signalering i IPR påvirker retningen af cellevækst og muligvis positionen af celledelingsplanet.
a, b Varmekort over gennemsnitlig overfladevækst (a) og vækstanisotropi (b) i SAM gennemsnitligt over syv uafhængige planter (brugt som proxyer for henholdsvis styrken og retningen af celleekspansion). c PCA-analyse omfattede følgende variabler: GA-signal, overfladevækstintensitet, overfladevækstanisotropi og CLV3-ekspression. PCA-komponent 1 var primært negativt korreleret med overfladevækstintensitet og positivt korreleret med GA-signal. PCA-komponent 2 var primært positivt korreleret med overfladevækstanisotropi og negativt korreleret med CLV3-ekspression. Procenter repræsenterer den variation, der forklares af hver komponent. d Spearman-korrelationsanalyse mellem GA-signal, overfladevækstintensitet og overfladevækstanisotropi på vævsskala eksklusive CZ. Tallet til højre er Spearman rho-værdien mellem to variabler. Stjerner angiver tilfælde, hvor korrelationen/negativ korrelation er meget signifikant. e 3D-visualisering af Col-0 SAM L1-celler ved konfokalmikroskopi. Nye cellevægge dannet i SAM (men ikke primordium) efter 10 timer er farvet i henhold til deres vinkelværdier. Farvebjælken vises i nederste højre hjørne. Indsætningen viser det tilsvarende 3D-billede ved 0 timer. Eksperimentet blev gentaget to gange med lignende resultater. f Boksplot viser celledelingshastigheder i IPR og ikke-IPR Col-0 SAM (n = 10 uafhængige planter). Centerlinjen viser medianen, og boksgrænserne angiver den 25. og 75. percentil. Knurhår angiver minimums- og maksimumværdierne bestemt med R-software. P-værdier blev opnået med Welchs tosidede t-test. g, h Skematisk diagram, der viser (g) hvordan man måler vinklen på den nye cellevæg (magenta) i forhold til den radiale retning fra midten af SAM (hvid stiplet linje) (kun spidse vinkelværdier, dvs. 0-90°, tages i betragtning), og (h) de omkredsmæssige/laterale og radiale retninger inden for meristemet. i Frekvenshistogrammer for celledelingsplanorientering på tværs af SAM (mørkeblå), IPR (mellemblå) og ikke-IPR (lyseblå). P-værdier blev opnået ved en tosidet Kolmogorov-Smirnov-test. Eksperimentet blev gentaget to gange med lignende resultater. j Frekvenshistogrammer af celledelingsplanets orientering af IPR omkring henholdsvis P3 (lysegrøn), P4 (mellemgrøn) og P5 (mørkegrøn). P-værdier blev opnået ved en tosidet Kolmogorov-Smirnov-test. Eksperimentet blev gentaget to gange med lignende resultater.
Derfor undersøgte vi derefter korrelationen mellem GA-signalering og celledelingsaktivitet ved at identificere nydannede cellevægge under analysen (fig. 5e). Denne tilgang gjorde det muligt for os at måle hyppigheden og retningen af celledeling. Overraskende nok fandt vi, at hyppigheden af celledelinger i IPR og resten af SAM (ikke-IPR, fig. 5f) var ens, hvilket indikerer, at forskelle i GA-signalering mellem IPR- og ikke-IPR-celler ikke signifikant påvirker celledelingen. Dette, sammen med den positive korrelation mellem GA-signalering og vækstanisotropi, fik os til at overveje, om GA-signaleringsaktivitet kunne påvirke orienteringen af celledelingsplanet. Vi målte orienteringen af den nye cellevæg som en spids vinkel i forhold til den radiale akse, der forbinder meristemcentret og midten af den nye cellevæg (fig. 5e-i) og observerede en klar tendens til, at celler deler sig i vinkler tæt på 90° i forhold til den radiale akse, med de højeste frekvenser observeret ved 70-80° (23,28%) og 80-90° (22,62%) (fig. 5e,i), svarende til celledelinger i den cirkumferentielle/tværgående retning (fig. 5h). For at undersøge GA-signaleringens bidrag til denne celledelingsadfærd analyserede vi celledelingsparametre i IPR og ikke-IPR separat (fig. 5i). Vi observerede, at delingsvinkelfordelingen i IPR-celler afveg fra den i ikke-IPR-celler eller i celler i hele SAM, hvor IPR-celler udviste en højere andel af laterale/cirkulære celledelinger, dvs. 70-80° og 80-90° (henholdsvis 33,86% og 30,71%, tilsvarende proportioner) (fig. 5i). Vores observationer afslørede således en sammenhæng mellem høj GA-signalering og en celledelingsplanorientering tæt på den cirkumferentielle retning, svarende til korrelationen mellem GA-signalaktivitet og vækstanisotropi (fig. 5c, d). For yderligere at fastslå den rumlige konservering af denne sammenhæng målte vi delingsplanorienteringen i IPR-celler omkring primordium startende fra P3, da den højeste GA-signalaktivitet blev detekteret i denne region startende fra P4 (fig. 4). Delingsvinklerne for IPR omkring P3 og P4 viste ingen statistisk signifikante forskelle, selvom en øget hyppighed af laterale celledelinger blev observeret i IPR omkring P4 (fig. 5j). I IPR-cellerne omkring P5 blev forskellen i orienteringen af celledelingsplanet imidlertid statistisk signifikant, med en kraftig stigning i hyppigheden af tværgående celledelinger (fig. 5j). Samlet set tyder disse resultater på, at GA-signalering kan kontrollere orienteringen af celledelinger i SAM, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter40,41 om, at høj GA-signalering kan inducere lateral orientering af celledelinger i IPR.
Det forudsiges, at celler i IPR ikke vil blive inkorporeret i primordia, men snarere i internoder2,42,43. Den tværgående orientering af celledelinger i IPR kan resultere i den typiske organisering af parallelle longitudinelle rækker af epidermale celler i internoder. Vores observationer beskrevet ovenfor tyder på, at GA-signalering sandsynligvis spiller en rolle i denne proces ved at regulere retningen af celledeling.
Funktionstab af flere DELLA-gener resulterer i et konstitutivt GA-respons, og della-mutanter kan bruges til at teste denne hypotese44. Vi analyserede først ekspressionsmønstrene for fem DELLA-gener i SAM. Transkriptionel fusion af GUS-linjen45 afslørede, at GAI, RGA, RGL1 og RGL2 (i en langt mindre grad) blev udtrykt i SAM (Supplerende Fig. 11a-d). In situ-hybridisering viste yderligere, at GAI mRNA akkumuleres specifikt i primordia og udviklende blomster (Supplerende Fig. 11e). RGL1- og RGL3-mRNA blev detekteret i hele SAM-kronen og i ældre blomster, hvorimod RGL2-mRNA var mere rigeligt i kantregionen (Supplerende Fig. 11f-h). Konfokal billeddannelse af pRGL3::RGL3-GFP SAM bekræftede den ekspression, der blev observeret ved in situ-hybridisering, og viste, at RGL3-protein akkumuleres i den centrale del af SAM (Supplerende Fig. 11i). Ved hjælp af pRGA::GFP-RGA-linjen fandt vi også, at RGA-protein akkumuleres i SAM, men dets forekomst falder ved grænsen startende fra P4 (Supplerende Fig. 11j). Bemærkelsesværdigt er ekspressionsmønstrene for RGL3 og RGA i overensstemmelse med højere GA-signalaktivitet i IPR, som detekteret af qmRGA (Fig. 4). Desuden indikerer disse data, at alle DELLA'er udtrykkes i SAM, og at deres ekspression samlet set spænder over hele SAM.
Vi analyserede derefter celledelingsparametrene i vildtype-SAM (Ler, kontrol) og gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globale) mutanter (fig. 6a, b). Interessant nok observerede vi et statistisk signifikant skift i fordelingen af celledelingsvinkelfrekvenser i della global mutant SAM sammenlignet med vildtypen (fig. 6c). Denne ændring i della global mutant skyldtes en stigning i hyppigheden af 80-90° vinkler (34,71% vs. 24,55%) og i mindre grad 70-80° vinkler (23,78% vs. 20,18%), dvs. svarende til tværgående celledelinger (fig. 6c). Hyppigheden af ikke-tværgående delinger (0-60°) var også lavere i della global mutant (fig. 6c). Hyppigheden af tværgående celledelinger var signifikant forøget i SAM i della global mutant (fig. 6b). Hyppigheden af tværgående celledelinger i IPR var også højere i della global-mutanten sammenlignet med vildtypen (fig. 6d). Uden for IPR-regionen havde vildtypen en mere ensartet fordeling af celledelingsvinkler, hvorimod della global-mutanten foretrak tangentielle delinger ligesom IPR (fig. 6e). Vi kvantificerede også orienteringen af celledelinger i SAM af ga2-oxidase (ga2ox) femtedelsmutanter (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 og ga2ox6-2), en GA-inaktiv mutantbaggrund, hvor GA akkumuleres. I overensstemmelse med stigningen i GA-niveauer var SAM'en i den quintuple ga2ox-mutantblomsterstand større end i Col-0 (Supplerende Fig. 12a, b), og sammenlignet med Col-0 viste den quintuple ga2ox SAM en tydeligt anderledes fordeling af celledelingsvinkler, hvor vinkelfrekvensen steg fra 50° til 90°, dvs. igen favoriserede tangentielle delinger (Supplerende Fig. 12a-c). Vi viser således, at konstitutiv aktivering af GA-signalering og GA-akkumulering inducerer laterale celledelinger i IPR og resten af SAM.
a, b 3D-visualisering af L1-laget af PI-farvet Ler (a) og global della-mutant (b) SAM ved hjælp af konfokalmikroskopi. Nye cellevægge dannet i SAM (men ikke primordium) over en 10-timers periode er vist og farvet i henhold til deres vinkelværdier. Indsætningen viser SAM ved 0 timer. Farvebjælken vises i nederste højre hjørne. Pilen i (b) peger på et eksempel på justerede cellefiler i den globale della-mutant. Eksperimentet blev gentaget to gange med lignende resultater. ce sammenligning af frekvensfordelingen af celledelingsplanorienteringer i hele SAM (d), IP R (e) og ikke-IP R (f) mellem Ler og global della. P-værdier blev opnået ved hjælp af en tosidet Kolmogorov-Smirnov-test. f, g 3D-visualisering af konfokale billeder af PI-farvet SAM af Col-0 (i) og pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgene planter. Panelerne (a, b) viser nye cellevægge (men ikke primordier) dannet i SAM inden for 10 timer. Eksperimentet blev gentaget to gange med lignende resultater. h–j Sammenligning af frekvensfordelingen af celledelingsplanorienteringer placeret i hele SAM (h), IPR (i) og ikke-IPR (j) mellem Col-0 og pCUC2::gai-1-VENUS planter. P-værdier blev opnået ved hjælp af en tosidet Kolmogorov-Smirnov test.
Vi testede derefter effekten af at hæmme GA-signalering specifikt i IPR. Til dette formål brugte vi cotyledon cup 2 (CUC2) promotoren til at drive ekspressionen af et dominant negativt gai-1-protein fusioneret til VENUS (i pCUC2::gai-1-VENUS-linjen). I vildtype-SAM driver CUC2-promotoren ekspressionen af de fleste IPR'er i SAM, inklusive kantceller, fra P4 og fremefter, og lignende specifik ekspression blev observeret i pCUC2::gai-1-VENUS-planter (se nedenfor). Fordelingen af celledelingsvinkler på tværs af SAM eller IPR i pCUC2::gai-1-VENUS-planter var ikke signifikant forskellig fra vildtypens, selvom vi uventet fandt, at celler uden en IPR i disse planter delte sig med en højere frekvens på 80-90° (fig. 6f-j).
Det er blevet foreslået, at retningen af celledeling afhænger af SAM'ens geometri, især den trækspænding, der genereres af vævskrumningen46. Vi spurgte derfor, om SAM'ens form var ændret i della global mutant- og pCUC2::gai-1-VENUS-planterne. Som tidligere rapporteret12 var størrelsen af della global mutant-SAM større end vildtypens (Supplerende Fig. 13a, b, d). In situ-hybridisering af CLV3 og STM RNA bekræftede meristemekspansionen i della-mutanter og viste yderligere den laterale ekspansion af stamcellenichen (Supplerende Fig. 13e, f, h, i). SAM-krumningen var dog ens i begge genotyper (Supplerende Fig. 13k, m, n, p). Vi observerede en lignende stigning i størrelse i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant uden en ændring i krumning sammenlignet med vildtypen (Supplerende Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Hyppigheden af celledelingsorientering blev også påvirket i della quadruple-mutanten, men i mindre grad end i della monolitiske mutant (Supplerende Fig. 12d-f). Denne doseringseffekt, sammen med manglen på en effekt på krumning, antyder, at resterende RGL3-aktivitet i Della quadruple-mutanten begrænser ændringer i celledelingsorientering forårsaget af tab af DELLA-aktivitet, og at ændringer i laterale celledelinger forekommer som reaktion på ændringer i GA-signalaktivitet snarere end ændringer i SAM-geometri. Som beskrevet ovenfor driver CUC2-promotoren IPR-ekspression i SAM startende ved P4 (Supplerende Fig. 14a, b), og i modsætning hertil havde pCUC2::gai-1-VENUS SAM en reduceret størrelse, men højere krumning (Supplerende Fig. 14c-h). Denne ændring i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologien kan resultere i en anden fordeling af mekaniske belastninger sammenlignet med vildtypen, hvor høje cirkumferentielle belastninger starter i en kortere afstand fra SAM-centret47. Alternativt kan ændringerne i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologien skyldes ændringer i regionale mekaniske egenskaber induceret af transgenekspression48. I begge tilfælde kan dette delvist opveje virkningerne af ændringer i GA-signalering ved at øge sandsynligheden for, at cellerne deler sig i den cirkumferentielle/tværgående orientering, hvilket forklarer vores observationer.
Samlet set bekræfter vores data, at højere GA-signalering spiller en aktiv rolle i den laterale orientering af celledelingsplanet i IPR. De viser også, at meristemkrumning også påvirker orienteringen af celledelingsplanet i IPR.
Den tværgående orientering af delingsplanet i IPR, på grund af høj GA-signalaktivitet, antyder, at GA præorganiserer en radial cellefil i epidermis inden for SAM for at definere den cellulære organisation, der senere vil blive fundet i den epidermale internode. Faktisk var sådanne cellefiler ofte synlige i SAM-billeder af della global-mutanter (fig. 6b). For yderligere at undersøge den udviklingsmæssige funktion af det rumlige mønster af GA-signalering i SAM, brugte vi derfor time-lapse-billeddannelse til at analysere den rumlige organisation af celler i IPR i vildtype (Ler og Col-0), della global-mutanter og pCUC2::gai-1-VENUS transgene planter.
Vi fandt, at qmRGA viste, at GA-signalaktiviteten i IPR steg fra P1/P2 og toppede ved P4, og dette mønster forblev konstant over tid (fig. 4a-f og supplerende fig. 8c-f, k). For at analysere den rumlige organisering af celler i IPR med stigende GA-signal, mærkede vi Ler IPR-celler over og ved siderne af P4 i henhold til deres udviklingsmæssige skæbne analyseret 34 timer efter den første observation, dvs. mere end to plastidtider, hvilket tillod os at følge IPR-celler under primordiumudvikling fra P1/P2 til P4. Vi brugte tre forskellige farver: gul for de celler, der var integreret i primordium nær P4, grøn for dem, der var i IPR, og lilla for dem, der deltog i begge processer (fig. 7a-c). Ved t0 (0 timer) var 1-2 lag af IPR-celler synlige foran P4 (fig. 7a). Som forventet, når disse celler delte sig, gjorde de det hovedsageligt via det tværgående delingsplan (fig. 7a-c). Lignende resultater blev opnået ved brug af Col-0 SAM (med fokus på P3, hvis kant folder sig på samme måde som P4 i Ler), selvom folden dannet ved blomsterkanten i denne genotype skjulte IPR-cellerne hurtigere (fig. 7g-i). Delingsmønsteret for IPR-celler præorganiserer således cellerne i radiale rækker, som i internoder. Organiseringen af radiale rækker og lokaliseringen af IPR-celler mellem successive organer antyder, at disse celler er internodale progenitorer.
Her udviklede vi en ratiometrisk GA-signaleringsbiosensor, qmRGA, der muliggør kvantitativ kortlægning af GA-signaleringsaktivitet som følge af kombinerede GA- og GA-receptorkoncentrationer, samtidig med at interferens med endogene signalveje minimeres, hvorved information om GA-funktion på celleniveau gives. Til dette formål konstruerede vi et modificeret DELLA-protein, mRGA, der har mistet evnen til at binde DELLA-interaktionspartnere, men som forbliver følsomt over for GA-induceret proteolyse. qmRGA reagerer på både eksogene og endogene ændringer i GA-niveauer, og dets dynamiske registreringsegenskaber muliggør vurdering af spatiotemporale ændringer i GA-signaleringsaktivitet under udvikling. qmRGA er også et meget fleksibelt værktøj, da det kan tilpasses forskellige væv ved at ændre den promotor, der anvendes til dets ekspression (hvis nødvendigt), og i betragtning af den bevarede natur af GA-signalvejen og PFYRE-motivet på tværs af angiospermer, er det sandsynligt, at det kan overføres til andre arter22. I overensstemmelse med dette blev en tilsvarende mutation i ris-SLR1 DELLA-proteinet (HYY497AAA) også vist at undertrykke vækstrepressoraktiviteten af SLR1, mens den kun reducerede dens GA-medierede nedbrydning en smule, svarende til mRGA23. Det er værd at bemærke, at nylige undersøgelser i Arabidopsis viste, at en enkelt aminosyremutation i PFYRE-domænet (S474L) ændrede den transkriptionelle aktivitet af RGA uden at påvirke dens evne til at interagere med transkriptionsfaktorpartnere50. Selvom denne mutation er meget tæt på de 3 aminosyresubstitutioner, der findes i mRGA, viser vores undersøgelser, at disse to mutationer ændrer forskellige karakteristika ved DELLA. Selvom de fleste transkriptionsfaktorpartnere binder til LHR1- og SAW-domænerne i DELLA26,51, kan nogle konserverede aminosyrer i PFYRE-domænet hjælpe med at stabilisere disse interaktioner.
Udvikling af internoder er et nøgletræk i plantearkitektur og udbytteforbedring. qmRGA afslørede højere GA-signalaktivitet i IPR-internodeprogenitorceller. Ved at kombinere kvantitativ billeddannelse og genetik viste vi, at GA-signalmønstre overlejrer cirkulære/tværgående celledelingsplaner i SAM-epidermis og former den celledelingsorganisation, der kræves for internodeudvikling. Adskillige regulatorer af celledelingsplanorientering er blevet identificeret under udviklingen52,53. Vores arbejde giver et klart eksempel på, hvordan GA-signalaktivitet regulerer denne cellulære parameter. DELLA kan interagere med præfoldende proteinkomplekser41, så GA-signalering kan regulere celledelingsplanorientering ved direkte at påvirke kortikale mikrotubulusorientering40,41,54,55. Vi viste uventet, at korrelatet for højere GA-signalaktivitet i SAM ikke var celleforlængelse eller -deling, men kun vækstanisotropi, hvilket er i overensstemmelse med en direkte effekt af GA på retningen af celledeling i IPR. Vi kan dog ikke udelukke, at denne effekt også kan være indirekte, for eksempel medieret af GA-induceret blødgøring af cellevægge56. Ændringer i cellevæggens egenskaber inducerer mekanisk stress57,58, som også kan påvirke orienteringen af celledelingsplanet ved at påvirke orienteringen af kortikale mikrotubuli39,46,59. De kombinerede effekter af GA-induceret mekanisk stress og direkte regulering af mikrotubulusorientering af GA kan være involveret i at generere et specifikt mønster af celledelingsorientering i IPR for at definere internoder, og yderligere undersøgelser er nødvendige for at teste denne idé. Tilsvarende har tidligere undersøgelser fremhævet vigtigheden af DELLA-interagerende proteiner TCP14 og 15 i kontrollen af internodedannelse60,61, og disse faktorer kan mediere virkningen af GA sammen med BREVIPEDICELLUS (BP) og PENNYWISE (PNY), som regulerer internodeudvikling og har vist sig at påvirke GA-signalering2,62. I betragtning af at DELLA'er interagerer med signalveje for brassinosteroid, ethylen, jasmonsyre og abscisinsyre (ABA)63,64, og at disse hormoner kan påvirke mikrotubulusorientering65, kan virkningerne af GA på celledelingsorientering også medieres af andre hormoner.
Tidlige cytologiske studier viste, at både de indre og ydre regioner af Arabidopsis SAM er nødvendige for udvikling af internoder2,42. Det faktum, at GA aktivt regulerer celledeling i det indre væv12, understøtter en dobbelt funktion af GA i reguleringen af meristem og internodestørrelse i SAM. Mønsteret for retningsbestemt celledeling er også tæt reguleret i det indre SAM-væv, og denne regulering er essentiel for stængelvækst52. Det vil være interessant at undersøge, om GA også spiller en rolle i orienteringen af celledelingsplanet i den indre SAM-organisation og derved synkroniserer specifikationen og udviklingen af internoder i SAM.
Planter blev dyrket in vitro i jord eller 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) suppleret med 1% sukrose og 1% agar (Sigma) under standardbetingelser (16 timers lys, 22 °C), bortset fra hypokotyl- og rodvækstforsøg, hvor kimplanter blev dyrket på vertikale plader under konstant lys og 22 °C. Til nitratforsøg blev planterne dyrket på modificeret MS-medium (bioWORLD plantemedium) suppleret med tilstrækkelig nitrat (0 eller 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinat, 1% sukrose og 1% A-agar (Sigma) under lange dagsbetingelser.
GID1a cDNA indsat i pDONR221 blev rekombineret med pDONR P4-P1R-pUBQ10 og pDONR P2R-P3-mCherry i pB7m34GW for at generere pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA indsat i pDONR221 blev rekombineret i pB7RWG266 for at generere p35S:IDD2-RFP. For at generere pGID1b::2xmTQ2-GID1b blev et 3,9 kb fragment opstrøms for GID1b-kodningsregionen og et 4,7 kb fragment indeholdende GID1b-cDNA'et (1,3 kb) og terminatoren (3,4 kb) først amplificeret ved hjælp af primerne i Supplerende Tabel 3 og derefter indsat i henholdsvis pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) og pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) og endelig rekombineret med pDONR221 2xmTQ268 i pGreen 012567-målvektoren ved hjælp af Gateway-kloning. For at generere pCUC2::LSSmOrange blev CUC2-promotorsekvensen (3229 bp opstrøms for ATG) efterfulgt af kodningssekvensen for stor Stokes-skiftet mOrange (LSSmOrange)69 med N7-nuklearlokaliseringssignalet og NOS-transkriptionsterminatoren samlet i pGreen kanamycin-målretningsvektoren ved hjælp af Gateway 3-fragment rekombinationssystemet (Invitrogen). Den binære plantevektor blev introduceret i Agrobacterium tumefaciens-stammen GV3101 og introduceret i Nicotiana benthamiana-blade ved hjælp af Agrobacterium-infiltrationsmetode og i Arabidopsis thaliana Col-0 ved hjælp af blomsterdypningsmetode. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry og pCLV3::mCherry-NLS qmRGA blev isoleret fra henholdsvis F3- og F1-afkommet fra de respektive krydsninger.
RNA in situ-hybridisering blev udført på ca. 1 cm lange skudspidser72, som blev opsamlet og straks fikseret i FAA-opløsning (3,7% formaldehyd, 5% eddikesyre, 50% ethanol) forkølet til 4 °C. Efter 2 × 15 minutters vakuumbehandling blev fikseringsmidlet ændret, og prøverne blev inkuberet natten over. GID1a-, GID1b-, GID1c-, GAI-, RGL1-, RGL2- og RGL3-cDNA'er og antisense-prober til deres 3'-UTR'er blev syntetiseret ved hjælp af primerne vist i supplerende tabel 3 som beskrevet af Rosier et al.73. Digoxigenin-mærkede prober blev immunodetekteret ved hjælp af digoxigenin-antistoffer (3000-fold fortynding; Roche, katalognummer: 11 093 274 910), og snit blev farvet med 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP, 250-fold fortynding)/nitroblåt tetrazolium (NBT, 200-fold fortynding) opløsning.
Opslagstidspunkt: 10. feb. 2025