DELLA-proteiner er konserveredevækstregulatorersom spiller en central rolle i planteudviklingen som reaktion på interne og eksterne signaler. Som transkriptionelle regulatorer binder DELLA'er til transkriptionsfaktorer (TF'er) og histon H2A via deres GRAS-domæner og rekrutteres til at virke på promotorer. Nylige undersøgelser har vist, at DELLA-stabilitet reguleres post-translationelt af to mekanismer: polyubiquitinering induceret af plantehormonetgibberellin, hvilket fører til deres hurtige nedbrydning, og konjugation med lille ubiquitin-lignende modifikator (SUMO), hvilket øger deres akkumulering. Desuden reguleres DELLA-aktivitet dynamisk af to forskellige glycosyleringsmekanismer: O-fucosylering øger DELLA-TF-interaktion, hvorimod O-bundet N-acetylglucosamin (O-GlcNAc) modifikation hæmmer DELLA-TF-interaktion. Rollen af DELLA-phosphorylering er imidlertid uklar, da tidligere undersøgelser har vist modstridende resultater, hvor nogle tyder på, at fosforylering fremmer eller undertrykker DELLA-nedbrydning, og andre tyder på, at fosforylering ikke påvirker deres stabilitet. Her identificerer vi phosphoryleringssteder i GA1-3-repressoren (RGA), AtDELLA, oprenset fra Arabidopsis thaliana ved massespektrometri og viser, at phosphorylering af to RGA-peptider i PolyS- og PolyS/T-regionerne øger RGA-aktivitet ved at fremme H2A-binding og RGA-associering med målpromotorer. Især påvirkede phosphorylering ikke RGA-TF-interaktioner eller RGA-stabilitet. Vores undersøgelse afslører en molekylær mekanisme, hvorved phosphorylering inducerer DELLA-aktivitet.
Vores massespektrometriske analyse afslørede, at både Pep1 og Pep2 var stærkt phosphoryleret i RGA i den GA-mangelfulde Ga1-baggrund. Ud over denne undersøgelse har phosphoproteomiske undersøgelser også afsløret Pep1-phosphorylering i RGA, selvom dens rolle endnu ikke er blevet undersøgt53,54,55. I modsætning hertil er Pep2-phosphorylering ikke tidligere blevet beskrevet, da dette peptid kun kunne påvises under anvendelse af RGAGKG-transgenet. Selvom m1A-mutationen, som afskaffede Pep1-phosphorylering, kun reducerede RGA-aktiviteten i planta en smule, havde den en additiv virkning, når den kombineres med m2A til at reducere RGA-aktivitet (Supplerende figur 6). Det er vigtigt, at Pep1-phosphorylering blev signifikant reduceret i den GA-forstærkede sly1-mutant sammenlignet med ga1, hvilket tyder på, at GA fremmer RGA-dephosphorylering, hvilket reducerer dens aktivitet. Mekanismen, hvorved GA undertrykker RGA-phosphorylering, kræver yderligere undersøgelse. En mulighed er, at dette opnås gennem regulering af en uidentificeret proteinkinase. Selvom undersøgelser har vist, at ekspression af CK1-proteinkinase EL1 nedreguleres af GA i ris41, viser vores resultater, at højere ordens mutationer af Arabidopsis EL1-homologen (AEL1-4) ikke reducerer RGA-phosphorylering. I overensstemmelse med vores resultater identificerede en nylig phosphoproteomisk undersøgelse med Arabidopsis AEL-overudtrykkende linjer og en ael triple mutant ingen DELLA-proteiner som substrater for disse kinaser56. Da vi udarbejdede manuskriptet, blev det rapporteret, at GSK3, genet der koder for en GSK3/SHAGGY-lignende kinase i hvede (Triticum aestivum), kan phosphorylere DELLA (Rht-B1b)57, selvom fosforylering af Rht-B1b af GSK3 ikke er blevet bekræftet i planta. In vitro enzymatiske reaktioner i nærvær af GSK3 efterfulgt af massespektrometrianalyse afslørede tre phosphoryleringssteder placeret mellem DELLA- og GRAS-domænerne af Rht-B1b (Supplerende Fig. 3). Serin til alanin substitutioner på alle tre phosphoryleringssteder resulterede i nedsat Rht-B1b aktivitet i transgen hvede, i overensstemmelse med vores resultater, at alanin substitutioner i Pep2 RGA nedsatte RGA aktivitet. Imidlertid viste in vitro proteinnedbrydningsassays yderligere, at phosphorylering også kan stabilisere Rht-B1b57. Dette er i modsætning til vores resultater, der viser, at alaninsubstitutioner i Pep2 RGA ikke ændrer dets stabilitet i planta. GSK3 i hvede er en ortolog af brassinosteroid-ufølsomt protein 2 (BIN2) i Arabidopsis 57. BIN2 er en negativ regulator af BR-signalering, og BR aktiverer dens signalvej ved at forårsage BIN2-nedbrydning 58. Vi viste, at BR-behandling ikke reducerer RGA-stabilitet 59 eller arabidolementært phosphorylpsi-niveau (Fig. tyder på, at RGA sandsynligvis ikke bliver phosphoryleret af BIN2.
Alle kvantitative data blev statistisk analyseret ved hjælp af Excel, og signifikante forskelle blev bestemt ved hjælp af Students t-test. Der blev ikke brugt statistiske metoder til at forudbestemme stikprøvestørrelsen. Ingen data blev udelukket fra analysen; eksperimentet var ikke randomiseret; og forskerne var opmærksomme på tildelingen under forsøget og resultatvurderingen. Prøvestørrelser er angivet i figurforklaringerne og i rådatafilerne.
Indlægstid: 15-apr-2025