DELLA-proteiner er konserveredevækstregulatorerder spiller en central rolle i planteudvikling som reaktion på interne og eksterne signaler. Som transkriptionelle regulatorer binder DELLA'er sig til transkriptionsfaktorer (TF'er) og histon H2A via deres GRAS-domæner og rekrutteres til at virke på promotorer. Nyere undersøgelser har vist, at DELLA-stabilitet reguleres posttranslationelt af to mekanismer: polyubiquitinering induceret af plantehormonetgibberellin, hvilket fører til deres hurtige nedbrydning, og konjugering med lille ubiquitin-lignende modifikator (SUMO), hvilket øger deres akkumulering. Desuden reguleres DELLA-aktivitet dynamisk af to forskellige glycosyleringsmekanismer: O-fucosylering forstærker DELLA-TF-interaktion, hvorimod O-bundet N-acetylglucosamin (O-GlcNAc)-modifikation hæmmer DELLA-TF-interaktion. Rollen af DELLA-fosforylering er dog uklar, da tidligere undersøgelser har vist modstridende resultater, hvor nogle antyder, at fosforylering fremmer eller undertrykker DELLA-nedbrydning, og andre antyder, at fosforylering ikke påvirker deres stabilitet. Her identificerer vi fosforyleringssteder i GA1-3-repressoren (RGA), AtDELLA, oprenset fra Arabidopsis thaliana ved massespektrometri, og viser, at fosforylering af to RGA-peptider i PolyS- og PolyS/T-regionerne forstærker RGA-aktivitet ved at fremme H2A-binding og RGA-association med målpromotorer. Bemærkelsesværdigt påvirkede fosforylering ikke RGA-TF-interaktioner eller RGA-stabilitet. Vores undersøgelse afslører en molekylær mekanisme, hvorved fosforylering inducerer DELLA-aktivitet.
Vores massespektrometriske analyse viste, at både Pep1 og Pep2 var stærkt fosforyleret i RGA i den GA-deficiente Ga1-baggrund. Ud over denne undersøgelse har fosfoproteomiske undersøgelser også afsløret Pep1-fosforylering i RGA, selvom dens rolle endnu ikke er undersøgt53,54,55. I modsætning hertil er Pep2-fosforylering ikke tidligere blevet beskrevet, da dette peptid kun kunne detekteres ved hjælp af RGAGKG-transgenet. Selvom m1A-mutationen, som afskaffede Pep1-fosforylering, kun reducerede RGA-aktiviteten en smule i planta, havde den en additiv effekt, når den kombineredes med m2A, i reduktionen af RGA-aktivitet (Supplerende Figur 6). Det er vigtigt at bemærke, at Pep1-fosforylering var signifikant reduceret i den GA-forstærkede sly1-mutant sammenlignet med ga1, hvilket tyder på, at GA fremmer RGA-defosforylering og dermed reducerer dens aktivitet. Mekanismen, hvorved GA undertrykker RGA-fosforylering, kræver yderligere undersøgelse. En mulighed er, at dette opnås gennem regulering af en uidentificeret proteinkinase. Selvom studier har vist, at ekspressionen af CK1-proteinkinasen EL1 nedreguleres af GA i ris41, indikerer vores resultater, at højereordensmutationer af Arabidopsis EL1-homologen (AEL1-4) ikke reducerer RGA-fosforylering. I overensstemmelse med vores resultater identificerede et nyligt fosfoproteomisk studie, der anvendte Arabidopsis AEL-overekspresserende linjer og en ael-tripelmutant, ingen DELLA-proteiner som substrater for disse kinaser56. Da vi udarbejdede manuskriptet, blev det rapporteret, at GSK3, genet der koder for en GSK3/SHAGGY-lignende kinase i hvede (Triticum aestivum), kan fosforylere DELLA (Rht-B1b)57, selvom fosforylering af Rht-B1b af GSK3 ikke er blevet bekræftet in planta. In vitro enzymatiske reaktioner i nærvær af GSK3 efterfulgt af massespektrometrianalyse afslørede tre fosforyleringssteder placeret mellem DELLA- og GRAS-domænerne i Rht-B1b (Supplerende figur 3). Serin- til alanin-substitutioner på alle tre fosforyleringssteder resulterede i nedsat Rht-B1b-aktivitet i transgen hvede, hvilket stemmer overens med vores fund om, at alanin-substitutioner i Pep2 RGA reducerede RGA-aktivitet. In vitro-proteinnedbrydningsanalyser viste imidlertid yderligere, at fosforylering også kan stabilisere Rht-B1b57. Dette står i kontrast til vores resultater, der viser, at alanin-substitutioner i Pep2 RGA ikke ændrer dets stabilitet in planta. GSK3 i hvede er en ortolog af brassinosteroid-ufølsomt protein 2 (BIN2) i Arabidopsis57. BIN2 er en negativ regulator af BR-signalering, og BR aktiverer dets signalvej ved at forårsage BIN2-nedbrydning58. Vi viste, at BR-behandling ikke reducerer RGA-stabilitet59 eller fosforyleringsniveauer i Arabidopsis (Supplerende Figur 2), hvilket tyder på, at RGA sandsynligvis ikke bliver fosforyleret af BIN2.
Alle kvantitative data blev statistisk analyseret ved hjælp af Excel, og signifikante forskelle blev bestemt ved hjælp af Student's t-test. Der blev ikke anvendt statistiske metoder til at forudbestemme stikprøvestørrelsen. Ingen data blev udeladt fra analysen; eksperimentet var ikke randomiseret; og forskerne var opmærksomme på allokeringen under eksperimentet og resultatvurderingen. Stikprøvestørrelserne er angivet i figurforklaringerne og i rådatafilerne.
Udsendelsestidspunkt: 15. april 2025