DELLA-proteiner er konserverede mastervækstregulatorersom spiller en central rolle i at kontrollere planteudviklingen som reaktion på interne og miljømæssige signaler. DELLA fungerer som en transkriptionel regulator og rekrutteres til at målrette promotorer ved at binde sig til transkriptionsfaktorer (TF'er) og histon H2A gennem dets GRAS-domæne. Nylige undersøgelser har vist, at DELLA-stabilitet er post-translationelt reguleret gennem to mekanismer: polyubiquitinering induceret af phytohormonet gibberellin, hvilket fører til dets hurtige nedbrydning, og konjugering af små ubiquitin-lignende modifikatorer (SUMO) for at øge dets akkumulering. Derudover reguleres DELLA-aktivitet dynamisk af to forskellige glycosyleringer: DELLA-TF-interaktionen forstærkes af O-fucosylering, men hæmmes af O-bundet N-acetylglucosamin (O-GlcNAc) modifikation. Rollen af DELLA-phosphorylering forbliver dog uklar, da tidligere undersøgelser har vist modstridende resultater, lige fra dem, der viser, at fosforylering fremmer eller reducerer DELLA-nedbrydning til andre, der viser, at fosforylering ikke påvirker dets stabilitet. Her identificerer vi phosphoryleringssteder i REPRESSORga1-3(RGA, AtDELLA) oprenset fra Arabidopsis thaliana ved massespektrometrianalyse og viser, at phosphorylering af to RGA-peptider ved PolyS- og PolyS/T-regionerne fremmer H2A-binding og øget RGA-aktivitet. Sammenslutning af RGA med målpromotorer. Fosforylering påvirker især ikke RGA-TF-interaktioner eller RGA-stabilitet. Vores undersøgelse afslører den molekylære mekanisme, hvorved phosphorylering inducerer DELLA-aktivitet.
For at belyse phosphoryleringens rolle i reguleringen af DELLA-funktionen er det afgørende at identificere DELLA-phosphoryleringssteder in vivo og udføre funktionelle analyser i planter. Ved affinitetsoprensning af planteekstrakter efterfulgt af MS/MS-analyse identificerede vi flere fosfositter i RGA. Under forhold med GA-mangel øges RHA-phosphorylering, men fosforylering påvirker ikke dets stabilitet. Det er vigtigt, at co-IP og ChIP-qPCR-assays afslørede, at phosphorylering ved PolyS/T-regionen af RGA fremmer dets interaktion med H2A og dets tilknytning til målpromotorer, hvilket afslører mekanismen, hvorved phosphorylering inducerer RGA-funktion.
RGA rekrutteres til at målrette kromatin gennem interaktionen af LHR1-subdomænet med TF og binder derefter til H2A gennem dets PolyS/T-region og PFYRE-subdomæne, og danner H2A-RGA-TF-komplekset for at stabilisere RGA. Fosforylering af Pep 2 i PolyS/T-regionen mellem DELLA-domænet og GRAS-domænet med en uidentificeret kinase øger RGA-H2A-binding. rgam2A-mutantproteinet ophæver RGA-phosphorylering og vedtager en anden proteinkonformation for at interferere med H2A-binding. Dette resulterer i destabilisering af forbigående TF-rgam2A-interaktioner og dissociation af rgam2A fra målkromatin. Denne figur viser kun RGA-medieret transkriptionel undertrykkelse. Et lignende mønster kunne beskrives for RGA-medieret transkriptionel aktivering, bortset fra at H2A-RGA-TF-komplekset ville fremme målgentransskription og dephosphorylering af rgam2A ville reducere transkription. Figur modificeret fra Huang et al.21.
Alle kvantitative data blev statistisk analyseret ved hjælp af Excel, og signifikante forskelle blev bestemt ved hjælp af Students t-test. Der blev ikke brugt statistiske metoder til foreløbig at bestemme stikprøvestørrelsen. Ingen data blev udelukket fra analysen; eksperimentet var ikke randomiseret; forskerne var ikke blinde for distributionen af data under eksperimentet og evalueringen af resultaterne. Prøvestørrelsen er angivet i figurforklaringen og kildedatafilen.
For mere information om undersøgelsesdesignet, se Natural Portfolio Report Abstract, der er knyttet til denne artikel.
Massespektrometri-proteomikdata er blevet bidraget til ProteomeXchange-konsortiet gennem PRIDE66-partnerlageret med datasætidentifikator PXD046004. Alle andre data opnået i løbet af denne undersøgelse er præsenteret i de supplerende oplysninger, supplerende datafiler og rådatafiler. Kildedata er angivet for denne artikel.
Indlægstid: 8-08-2024