Denne undersøgelse vurderede dødeligheden, subletaliteten og toksiciteten af kommercielcypermethrinformuleringer til anuran haletudser. I den akutte test blev koncentrationer på 100-800 μg/L testet i 96 timer. I den kroniske test blev naturligt forekommende cypermethrinkoncentrationer (1, 3, 6 og 20 μg/L) testet for dødelighed, efterfulgt af mikronukleustestning og nukleare abnormiteter i røde blodlegemer i 7 dage. LC50 for den kommercielle cypermethrin-formulering til haletudser var 273,41 μg L−1. I den kroniske test resulterede den højeste koncentration (20 μg L−1) i mere end 50 % dødelighed, da den dræbte halvdelen af de testede haletudser. Mikronukleustesten viste signifikante resultater ved 6 og 20 μg L−1, og adskillige nukleare abnormiteter blev påvist, hvilket indikerer, at den kommercielle cypermethrin-formulering har genotoksisk potentiale mod P. gracilis. Cypermethrin er en høj risiko for denne art, hvilket indikerer, at det kan forårsage flere problemer og påvirke dynamikken i dette økosystem på kort og lang sigt. Derfor kan det konkluderes, at kommercielle cypermethrinformuleringer har toksiske virkninger på P. gracilis.
På grund af den løbende udvidelse af landbrugsaktiviteter og intensiv anvendelse afskadedyrsbekæmpelseforanstaltninger udsættes vanddyr hyppigt for pesticider1,2. Forurening af vandressourcer nær landbrugsmarker kan påvirke udviklingen og overlevelsen af ikke-målorganismer såsom padder.
Padder bliver stadig vigtigere i vurderingen af miljømatricer. Anuraner betragtes som gode bioindikatorer for miljøforurenende stoffer på grund af deres unikke egenskaber såsom komplekse livscyklusser, hurtige larvevæksthastigheder, trofisk status, permeabel hud10,11, afhængighed af vand til reproduktion12 og ubeskyttede æg11,13,14. Den lille vandfrø (Physalaemus gracilis), almindeligvis kendt som den grædende frø, har vist sig at være en bioindikatorart for pesticidforurening4,5,6,7,15. Arten findes i stående vand, beskyttede områder eller områder med varierende levesteder i Argentina, Uruguay, Paraguay og Brasilien1617 og anses for stabil af IUCN-klassifikationen på grund af dens brede udbredelse og tolerance over for forskellige levesteder18.
Subletale virkninger er blevet rapporteret hos padder efter eksponering for cypermethrin, herunder adfærdsmæssige, morfologiske og biokemiske ændringer i haletudser23,24,25, ændret dødelighed og metamorfosetid, enzymatiske ændringer, nedsat udklækningssucces24,25, hyperaktivitet26, hæmning af cholinester-aktivitet, 7 ændringer i svømning27- og28-aktivitet. Undersøgelser af de genotoksiske virkninger af cypermethrin hos padder er dog begrænsede. Derfor er det vigtigt at vurdere anuranarters modtagelighed for cypermethrin.
Miljøforurening påvirker normal vækst og udvikling af padder, men den mest alvorlige negative effekt er genetiske skader på DNA forårsaget af pesticideksponering13. Blodcellemorfologianalyse er en vigtig bioindikator for forurening og potentiel toksicitet af et stof for vilde arter29. Mikronukleustesten er en af de mest almindeligt anvendte metoder til at bestemme genotoksiciteten af kemikalier i miljøet30. Det er en hurtig, effektiv og billig metode, der er en god indikator for kemisk forurening af organismer som padder31,32 og kan give information om eksponering for genotoksiske forurenende stoffer33.
Formålet med denne undersøgelse var at evaluere det toksiske potentiale af kommercielle cypermethrinformuleringer til små akvatiske haletudser ved hjælp af en mikronukleustest og økologisk risikovurdering.
Kumulativ dødelighed (%) af P. gracilis haletudser udsat for forskellige koncentrationer af kommerciel cypermethrin i den akutte periode af testen.
Kumulativ dødelighed (%) af P. gracilis haletudser udsat for forskellige koncentrationer af kommerciel cypermethrin under en kronisk test.
Den observerede høje dødelighed var et resultat af genotoksiske effekter hos padder udsat for forskellige koncentrationer af cypermethrin (6 og 20 μg/L), hvilket fremgår af tilstedeværelsen af mikrokerner (MN) og nukleare abnormiteter i erytrocytter. Dannelse af MN indikerer fejl i mitose og er forbundet med dårlig binding af kromosomer til mikrotubuli, defekter i proteinkomplekser, der er ansvarlige for kromosomoptagelse og transport, fejl i kromosomsegregering og fejl i reparation af DNA-skader38,39 og kan være relateret til pesticid-induceret oxidativ stress40,41. Andre abnormiteter blev observeret ved alle vurderede koncentrationer. Stigende cypermethrinkoncentrationer øgede nukleare abnormiteter i erytrocytter med henholdsvis 5 % og 20 % ved de laveste (1 μg/L) og højeste (20 μg/L) doser. For eksempel kan ændringer i en arts DNA have alvorlige konsekvenser for både kort- og langsigtet overlevelse, hvilket resulterer i befolkningstilbagegang, ændret forplantningsevne, indavl, tab af genetisk diversitet og ændrede migrationsrater. Alle disse faktorer kan påvirke arternes overlevelse og vedligeholdelse42,43. Dannelsen af erythroide abnormiteter kan indikere en blokering af cytokinesis, hvilket resulterer i unormal celledeling (binukleerede erytrocytter)44,45; multilobede kerner er fremspring af kernemembranen med flere lapper46, mens andre erythroide abnormiteter kan være forbundet med DNA-amplifikation, såsom nukleare nyrer/blebs47. Tilstedeværelsen af anukleerede erytrocytter kan indikere nedsat ilttransport, især i forurenet vand48,49. Apoptose indikerer celledød50.
Andre undersøgelser har også vist de genotoksiske virkninger af cypermethrin. Kabaña et al.51 påviste tilstedeværelsen af mikrokerner og nukleare ændringer såsom binukleerede celler og apoptotiske celler i Odontophrynus americanus-celler efter eksponering for høje koncentrationer af cypermethrin (5000 og 10.000 μg L−1) i 96 timer. Cypermethrin-induceret apoptose blev også påvist i P. biligonigerus52 og Rhinella arenarum53. Disse resultater tyder på, at cypermethrin har genotoksiske effekter på en række vandlevende organismer, og at MN- og ENA-analysen kan være en indikator for subletale virkninger på padder og kan være anvendelig på hjemmehørende arter og vilde populationer, der er udsat for giftstoffer12.
Kommercielle formuleringer af cypermethrin udgør en høj miljørisiko (både akut og kronisk), med hovedkvarterer, der overstiger niveauet for US Environmental Protection Agency (EPA)54, hvilket kan have en negativ indvirkning på arten, hvis den er til stede i miljøet. I den kroniske risikovurdering var NOEC for dødelighed 3 μg L−1, hvilket bekræfter, at de fundne koncentrationer i vand kan udgøre en risiko for arten55. Den dødelige NOEC for R. arenarum-larver udsat for en blanding af endosulfan og cypermethrin var 500 μg L−1 efter 168 timer; denne værdi faldt til 0,0005 μg L−1 efter 336 timer. Forfatterne viser, at jo længere eksponeringen er, desto lavere er de koncentrationer, der er skadelige for arten. Det er også vigtigt at fremhæve, at NOEC-værdierne var højere end for P. gracilis ved samme eksponeringstid, hvilket indikerer, at artsresponsen på cypermethrin er artsspecifik. Ydermere, hvad angår dødelighed, nåede CHQ-værdien af P. gracilis efter eksponering for cypermethrin 64,67, hvilket er højere end referenceværdien fastsat af US Environmental Protection Agency54, og CHQ-værdien for R. arenarum-larver var også højere end denne værdi (CHQ > 388,00 efter 336 timer), hvilket tyder på, at adskillige amphibiske arter risikerer høj risiko. I betragtning af, at P. gracilis kræver ca. 30 dage at fuldføre metamorfose56, kan det konkluderes, at de undersøgte koncentrationer af cypermethrin kan bidrage til befolkningsnedgang ved at forhindre inficerede individer i at komme ind i det voksne eller reproduktive stadium i en tidlig alder.
I den beregnede risikovurdering af mikrokerner og andre erytrocytkerneabnormaliteter varierede CHQ-værdierne fra 14,92 til 97,00, hvilket indikerer, at cypermethrin havde en potentiel genotoksisk risiko for P. gracilis selv i dets naturlige habitat. Under hensyntagen til dødelighed var den maksimale koncentration af xenobiotiske forbindelser, der kan tolereres for P. gracilis, 4,24 μg L−1. Koncentrationer så lave som 1 μg/L viste dog også genotoksiske effekter. Dette faktum kan føre til en stigning i antallet af unormale individer57 og påvirke udviklingen og reproduktionen af arter i deres levesteder, hvilket fører til et fald i paddebestandene.
Kommercielle formuleringer af insekticidet cypermethrin viste høj akut og kronisk toksicitet over for P. gracilis. Højere dødelighedsrater blev observeret, sandsynligvis på grund af toksiske virkninger, som vist ved tilstedeværelsen af mikrokerner og erythrocytkerneabnormiteter, især takkede kerner, lappede kerner og vesikulære kerner. Derudover viste de undersøgte arter øgede miljørisici, både akutte og kroniske. Disse data, kombineret med tidligere undersøgelser fra vores forskergruppe, viste, at selv forskellige kommercielle formuleringer af cypermethrin stadig forårsagede nedsatte acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BChE) aktiviteter og oxidativ stress58, og resulterede i ændringer i svømmeaktivitet og orale misdannelser59 i P. gracilis, hvilket indikerer, at kommercielle formuleringer af lethalpermethrin har høj lethalpermethrin. Hartmann et al. 60 fandt, at kommercielle formuleringer af cypermethrin var de mest toksiske for P. gracilis og en anden art af samme slægt (P. cuvieri) sammenlignet med ni andre pesticider. Dette tyder på, at lovligt godkendte koncentrationer af cypermethrin til miljøbeskyttelse kan resultere i høj dødelighed og langsigtet befolkningsnedgang.
Yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere pesticidets toksicitet over for padder, da de koncentrationer, der findes i miljøet, kan forårsage høj dødelighed og udgøre en potentiel risiko for P. gracilis. Forskning i paddearter bør fremmes, da data om disse organismer er sparsomme, især om brasilianske arter.
Den kroniske toksicitetstest varede i 168 timer (7 dage) under statiske forhold, og de subletale koncentrationer var: 1, 3, 6 og 20 μg ai L−1. I begge forsøg blev 10 haletudser pr. behandlingsgruppe evalueret med seks replikater, for i alt 60 haletudser pr. koncentration. I mellemtiden fungerede behandlingen med kun vand som en negativ kontrol. Hver forsøgsopstilling bestod af et sterilt glasfad med en kapacitet på 500 ml og en densitet på 1 haletudse pr. 50 ml opløsning. Kolben blev dækket med polyethylenfilm for at forhindre fordampning og blev kontinuerligt beluftet.
Vandet blev kemisk analyseret for at bestemme pesticidkoncentrationer ved 0, 96 og 168 timer. Ifølge Sabin et al. 68 og Martins et al. 69 blev analyserne udført på Pesticide Analysis Laboratory (LARP) ved Federal University of Santa Maria ved anvendelse af gaskromatografi koblet til tredobbelt quadrupol massespektrometri (Varian model 1200, Palo Alto, Californien, USA). Den kvantitative bestemmelse af pesticider i vand er vist som supplerende materiale (tabel SM1).
Til mikronukleustesten (MNT) og røde celle nuklear abnormalitetstesten (RNA) blev 15 haletudser fra hver behandlingsgruppe analyseret. Haletudser blev bedøvet med 5% lidocain (50 mg g-170), og blodprøver blev opsamlet ved hjertepunktur under anvendelse af hepariniserede engangssprøjter. Blodpræparater blev fremstillet på sterile mikroskopobjektglas, lufttørret, fikseret med 100 % methanol (4 °C) i 2 minutter og derefter farvet med 10 % Giemsa-opløsning i 15 minutter i mørke. Ved afslutningen af processen blev objektglassene vasket med destilleret vand for at fjerne overskydende plet og tørret ved stuetemperatur.
Mindst 1000 RBC'er fra hver haletudse blev analyseret ved hjælp af et 100× mikroskop med et 71 objektiv for at bestemme tilstedeværelsen af MN og ENA. I alt 75.796 RBC'er fra haletudser blev evalueret under hensyntagen til cypermethrinkoncentrationer og kontroller. Genotoksicitet blev analyseret ifølge metoden ifølge Carrasco et al. og Fenech et al. 38,72 ved at bestemme frekvensen af følgende nukleare læsioner: (1) anukleære celler: celler uden kerner; (2) apoptotiske celler: nuklear fragmentering, programmeret celledød; (3) binukleære celler: celler med to kerner; (4) nukleare knopper eller bleb-celler: celler med kerner med små fremspring af kernemembranen, blebs, der i størrelse svarer til mikrokerner; (5) karyolyserede celler: celler med kun omridset af kernen uden indre materiale; (6) kærvede celler: celler med kerner med tydelige revner eller hak i deres form, også kaldet nyreformede kerner; (7) lobulerede celler: celler med nukleare fremspring, der er større end de førnævnte vesikler; og (8) mikroceller: celler med kondenserede kerner og reduceret cytoplasma. Ændringerne blev sammenlignet med de negative kontrolresultater.
Resultaterne af akut toksicitetstest (LC50) blev analyseret ved hjælp af GBasic-software og TSK-Trimmed Spearman-Karber-metoden74. De kroniske testdata blev forudtestet for fejlnormalitet (Shapiro-Wilks) og varianshomogenitet (Bartlett). Resultaterne blev analyseret under anvendelse af envejsvariansanalyse (ANOVA). Tukeys test blev brugt til at sammenligne data indbyrdes, og Dunnetts test blev brugt til at sammenligne data mellem behandlingsgruppen og den negative kontrolgruppe.
LOEC- og NOEC-data blev analyseret ved hjælp af Dunnetts test. Statistiske test blev udført med Statistica 8.0 software (StatSoft) med et signifikansniveau på 95 % (p < 0,05).
Post tid: Mar-13-2025