Denne undersøgelse vurderede dødeligheden, subdødeligheden og toksiciteten af kommerciellecypermethrinformuleringer til anuranske haletudser. I den akutte test blev koncentrationer på 100-800 μg/L testet i 96 timer. I den kroniske test blev naturligt forekommende cypermethrinkoncentrationer (1, 3, 6 og 20 μg/L) testet for dødelighed, efterfulgt af mikronukleustest og nukleære abnormiteter i røde blodlegemer i 7 dage. LC50 for den kommercielle cypermethrinformulering til haletudser var 273,41 μg L−1. I den kroniske test resulterede den højeste koncentration (20 μg L−1) i mere end 50% dødelighed, da den dræbte halvdelen af de testede haletudser. Mikronukleustesten viste signifikante resultater ved 6 og 20 μg L−1, og der blev påvist adskillige nukleare abnormiteter, hvilket indikerer, at den kommercielle cypermethrinformulering har genotoksisk potentiale mod P. gracilis. Cypermethrin er en høj risiko for denne art, hvilket indikerer, at det kan forårsage flere problemer og påvirke dynamikken i dette økosystem på kort og lang sigt. Det kan derfor konkluderes, at kommercielle cypermethrinformuleringer har toksiske virkninger på P. gracilis.
På grund af den kontinuerlige udvidelse af landbrugsaktiviteter og intensiv anvendelse afskadedyrsbekæmpelseI henhold til foranstaltningerne udsættes vanddyr ofte for pesticider1,2. Forurening af vandressourcer nær landbrugsmarker kan påvirke udviklingen og overlevelsen af ikke-målorganismer såsom padder.
Padder bliver stadig vigtigere i vurderingen af miljømatricer. Anuraner betragtes som gode bioindikatorer for miljøforurenende stoffer på grund af deres unikke egenskaber såsom komplekse livscyklusser, hurtige larvevækstrater, trofiske status, permeabel hud10,11, afhængighed af vand til reproduktion12 og ubeskyttede æg11,13,14. Den lille vandfrø (Physalaemus gracilis), almindeligvis kendt som den grædende frø, har vist sig at være en bioindikatorart for pesticidforurening4,5,6,7,15. Arten findes i stillestående vand, beskyttede områder eller områder med varierende habitat i Argentina, Uruguay, Paraguay og Brasilien1617 og betragtes som stabil af IUCN-klassifikationen på grund af dens brede udbredelse og tolerance over for forskellige habitater18.
Subletale effekter er blevet rapporteret hos padder efter eksponering for cypermethrin, herunder adfærdsmæssige, morfologiske og biokemiske ændringer hos haletudser23,24,25, ændret dødelighed og metamorfosetid, enzymatiske ændringer, nedsat klækningssucces24,25, hyperaktivitet26, hæmning af kolinesteraseaktivitet27 og ændringer i svømmepræstationer7,28. Undersøgelser af de genotoksiske effekter af cypermethrin hos padder er dog begrænsede. Derfor er det vigtigt at vurdere anuranarters modtagelighed for cypermethrin.
Miljøforurening påvirker padders normale vækst og udvikling, men den mest alvorlige negative effekt er genetisk skade på DNA forårsaget af pesticideksponering13. Analyse af blodlegemers morfologi er en vigtig bioindikator for forurening og potentiel toksicitet af et stof for vilde arter29. Mikronukleustesten er en af de mest almindeligt anvendte metoder til at bestemme genotoksiciteten af kemikalier i miljøet30. Det er en hurtig, effektiv og billig metode, der er en god indikator for kemisk forurening af organismer såsom padder31,32 og kan give information om eksponering for genotoksiske forurenende stoffer33.
Formålet med denne undersøgelse var at evaluere det toksiske potentiale af kommercielle cypermethrinformuleringer for små akvatiske haletudser ved hjælp af en mikronukleustest og en økologisk risikovurdering.
Kumulativ dødelighed (%) af P. gracilis-haletudser udsat for forskellige koncentrationer af kommercielt cypermethrin i testens akutte periode.
Kumulativ dødelighed (%) af P. gracilis-haletudser udsat for forskellige koncentrationer af kommercielt cypermethrin under en kronisk test.
Den observerede høje dødelighed var et resultat af genotoksiske effekter hos padder udsat for forskellige koncentrationer af cypermethrin (6 og 20 μg/L), hvilket fremgår af tilstedeværelsen af mikrokerner (MN) og nukleare abnormiteter i erytrocytter. Dannelse af MN indikerer fejl i mitose og er forbundet med dårlig binding af kromosomer til mikrotubuli, defekter i proteinkomplekser, der er ansvarlige for kromosomoptagelse og -transport, fejl i kromosomsegregation og fejl i DNA-skadereparation38,39 og kan være relateret til pesticidinduceret oxidativ stress40,41. Andre abnormiteter blev observeret ved alle evaluerede koncentrationer. Stigende cypermethrinkoncentrationer øgede nukleare abnormiteter i erytrocytter med henholdsvis 5% og 20% ved de laveste (1 μg/L) og højeste (20 μg/L) doser. For eksempel kan ændringer i en arts DNA have alvorlige konsekvenser for både kort- og langsigtet overlevelse, hvilket resulterer i populationsnedgang, ændret reproduktiv fitness, indavl, tab af genetisk diversitet og ændrede migrationsrater. Alle disse faktorer kan påvirke arters overlevelse og opretholdelse42,43. Dannelsen af erythroide abnormiteter kan indikere en blokering i cytokinesen, hvilket resulterer i unormal celledeling (binukleære erytrocytter)44,45; flerfligede kerner er fremspring på kernemembranen med flere lapper46, mens andre erythroide abnormiteter kan være forbundet med DNA-amplifikation, såsom nukleare nyrer/blærer47. Tilstedeværelsen af anukleære erytrocytter kan indikere nedsat ilttransport, især i forurenet vand48,49. Apoptose indikerer celledød50.
Andre undersøgelser har også vist de genotoksiske virkninger af cypermethrin. Kabaña et al.51 påviste tilstedeværelsen af mikrokerner og kerneændringer såsom binukleære celler og apoptotiske celler i Odontophrynus americanus-celler efter eksponering for høje koncentrationer af cypermethrin (5000 og 10.000 μg L−1) i 96 timer. Cypermethrin-induceret apoptose blev også påvist i P. biligonigerus52 og Rhinella arenarum53. Disse resultater tyder på, at cypermethrin har genotoksiske virkninger på en række vandlevende organismer, og at MN- og ENA-analysen kan være en indikator for subletale virkninger på padder og kan være anvendelig på hjemmehørende arter og vilde populationer udsat for giftstoffer12.
Kommercielle formuleringer af cypermethrin udgør en høj miljøfare (både akut og kronisk), hvor HQ'erne overstiger det amerikanske miljøbeskyttelsesagenturs (EPA) niveau54, hvilket kan have en negativ indvirkning på arten, hvis den er til stede i miljøet. I den kroniske risikovurdering var NOEC for dødelighed 3 μg L−1, hvilket bekræfter, at de koncentrationer, der findes i vand, kan udgøre en risiko for arten55. Den letale NOEC for R. arenarum-larver udsat for en blanding af endosulfan og cypermethrin, var 500 μg L−1 efter 168 timer; denne værdi faldt til 0,0005 μg L−1 efter 336 timer. Forfatterne viser, at jo længere eksponeringen varer, desto lavere var de koncentrationer, der er skadelige for arten. Det er også vigtigt at fremhæve, at NOEC-værdierne var højere end for P. gracilis ved samme eksponeringstid, hvilket indikerer, at artens respons på cypermethrin er artsspecifik. Desuden nåede CHQ-værdien for P. gracilis efter eksponering for cypermethrin 64,67 med hensyn til dødelighed, hvilket er højere end referenceværdien fastsat af det amerikanske miljøbeskyttelsesagentur (Environmental Protection Agency)54, og CHQ-værdien for R. arenarum-larver var også højere end denne værdi (CHQ > 388,00 efter 336 timer), hvilket indikerer, at de undersøgte insekticider udgør en høj risiko for flere paddearter. I betragtning af at P. gracilis kræver cirka 30 dage for at fuldføre metamorfose56, kan det konkluderes, at de undersøgte koncentrationer af cypermethrin kan bidrage til populationsnedgang ved at forhindre inficerede individer i at komme ind i voksen- eller reproduktionsstadiet i en tidlig alder.
I den beregnede risikovurdering af mikrokerner og andre erytrocytkerneabnormaliteter varierede CHQ-værdierne fra 14,92 til 97,00, hvilket indikerer, at cypermethrin havde en potentiel genotoksisk risiko for P. gracilis, selv i dens naturlige habitat. Under hensyntagen til dødeligheden var den maksimale koncentration af xenobiotiske forbindelser, der kunne tolereres for P. gracilis, 4,24 μg L−1. Imidlertid viste koncentrationer så lave som 1 μg/L også genotoksiske effekter. Denne kendsgerning kan føre til en stigning i antallet af abnorme individer57 og påvirke udviklingen og reproduktionen af arter i deres habitater, hvilket kan føre til et fald i paddepopulationer.
Kommercielle formuleringer af insekticidet cypermethrin viste høj akut og kronisk toksicitet for P. gracilis. Der blev observeret højere dødelighed, sandsynligvis på grund af toksiske virkninger, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af mikrokerner og erytrocytkerneabnormiteter, især savtakkede kerner, fligede kerner og vesikulære kerner. Derudover viste de undersøgte arter øgede miljørisici, både akutte og kroniske. Disse data, kombineret med tidligere undersøgelser foretaget af vores forskergruppe, viste, at selv forskellige kommercielle formuleringer af cypermethrin stadig forårsagede nedsat acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BChE) aktivitet og oxidativ stress58, og resulterede i ændringer i svømmeaktivitet og orale misdannelser59 hos P. gracilis, hvilket indikerer, at kommercielle formuleringer af cypermethrin har høj letal og subletal toksicitet for denne art. Hartmann et al. 60 fandt, at kommercielle formuleringer af cypermethrin var de mest toksiske for P. gracilis og en anden art af samme slægt (P. cuvieri) sammenlignet med ni andre pesticider. Dette tyder på, at lovligt godkendte koncentrationer af cypermethrin til miljøbeskyttelse kan resultere i høj dødelighed og langsigtet populationsnedgang.
Yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere pesticidets toksicitet for padder, da de koncentrationer, der findes i miljøet, kan forårsage høj dødelighed og udgøre en potentiel risiko for P. gracilis. Forskning i paddearter bør fremmes, da data om disse organismer er knappe, især om brasilianske arter.
Testen for kronisk toksicitet varede i 168 timer (7 dage) under statiske forhold, og de subletale koncentrationer var: 1, 3, 6 og 20 μg ai L−1. I begge eksperimenter blev 10 haletudser pr. behandlingsgruppe evalueret med seks replikater, i alt 60 haletudser pr. koncentration. I mellemtiden fungerede behandlingen med kun vand som negativ kontrol. Hver forsøgsopstilling bestod af en steril glasskål med en kapacitet på 500 ml og en densitet på 1 haletudse pr. 50 ml opløsning. Kolben blev dækket med polyethylenfilm for at forhindre fordampning og blev kontinuerligt luftet.
Vandet blev kemisk analyseret for at bestemme pesticidkoncentrationerne ved 0, 96 og 168 timer. Ifølge Sabin et al. 68 og Martins et al. 69 blev analyserne udført på Pesticide Analysis Laboratory (LARP) ved Federal University of Santa Maria ved hjælp af gaskromatografi koblet til triple quadrupol massespektrometri (Varian model 1200, Palo Alto, Californien, USA). Den kvantitative bestemmelse af pesticider i vand er vist som supplerende materiale (Tabel SM1).
Til mikronukleustesten (MNT) og testen for nuklear abnormalitet i røde blodlegemer (RNA) blev 15 haletudser fra hver behandlingsgruppe analyseret. Haletudserne blev bedøvet med 5% lidokain (50 mg g-170), og blodprøverne blev indsamlet ved hjertepunktur med hepariniserede engangssprøjter. Blodudstryg blev fremstillet på sterile objektglas, lufttørret, fikseret med 100% methanol (4 °C) i 2 minutter og derefter farvet med 10% Giemsa-opløsning i 15 minutter i mørke. Ved afslutningen af processen blev objektglassene vasket med destilleret vand for at fjerne overskydende farvestof og tørret ved stuetemperatur.
Mindst 1000 røde blodlegemer fra hver haletudse blev analyseret ved hjælp af et 100× mikroskop med et 71-punkts objektiv for at bestemme tilstedeværelsen af MN og ENA. I alt 75.796 røde blodlegemer fra haletudser blev evalueret under hensyntagen til cypermethrinkoncentrationer og kontroller. Genotoksicitet blev analyseret i henhold til metoden fra Carrasco et al. og Fenech et al.38,72 ved at bestemme hyppigheden af følgende nukleare læsioner: (1) anukleære celler: celler uden kerner; (2) apoptotiske celler: nuklear fragmentering, programmeret celledød; (3) binukleære celler: celler med to kerner; (4) nukleare knopper eller blebceller: celler med kerner med små fremspring på kernemembranen, bleber af samme størrelse som mikrokerner; (5) karyolyserede celler: celler med kun kernens omrids uden indre materiale; (6) hakformede celler: celler med kerner med tydelige revner eller hak i deres form, også kaldet nyreformede kerner; (7) lobulerede celler: celler med kernefremspring større end de førnævnte vesikler; og (8) mikroceller: celler med kondenserede kerner og reduceret cytoplasma. Ændringerne blev sammenlignet med de negative kontrolresultater.
Resultaterne af den akutte toksicitetstest (LC50) blev analyseret ved hjælp af GBasic-software og TSK-Trimmed Spearman-Karber-metoden74. Dataene fra den kroniske test blev prætestet for fejlnormalitet (Shapiro-Wilks) og varianshomogenitet (Bartlett). Resultaterne blev analyseret ved hjælp af envejs-variansanalyse (ANOVA). Tukeys test blev brugt til at sammenligne data indbyrdes, og Dunnetts test blev brugt til at sammenligne data mellem behandlingsgruppen og den negative kontrolgruppe.
LOEC- og NOEC-data blev analyseret ved hjælp af Dunnetts test. Statistiske tests blev udført ved hjælp af Statistica 8.0-software (StatSoft) med et signifikansniveau på 95 % (p < 0,05).
Opslagstidspunkt: 13. marts 2025