Den sæsonbestemte fordeling af nedbør i Guizhou-provinsen er ujævn, med mere nedbør om foråret og sommeren, men rapsfrøplanterne er modtagelige for tørkestress om efteråret og vinteren, hvilket påvirker udbyttet alvorligt. Sennep er en speciel olieafgrøde, der hovedsageligt dyrkes i Guizhou-provinsen. Den har en stærk tørketolerance og kan dyrkes i bjergområder. Det er en rig ressource af tørkeresistente gener. Opdagelsen af tørkeresistente gener er af afgørende betydning for forbedringen af sennepssorter og innovation inden for kimplasma-ressourcer. GRF-familien spiller en afgørende rolle i planters vækst og udvikling og reaktion på tørkestress. I øjeblikket er GRF-gener blevet fundet i Arabidopsis 2, ris (Oryza sativa) 12, raps 13, bomuld (Gossypium hirsutum) 14, hvede (Triticum aestivum) 15, perlehirse (Setaria italica) 16 og Brassica 17, men der er ingen rapporter om GRF-gener påvist i sennep. I denne undersøgelse blev GRF-familiens gener i sennep identificeret på genomniveau, og deres fysiske og kemiske egenskaber, evolutionære relationer, homologi, konserverede motiver, genstruktur, genduplikeringer, cis-elementer og kimplantestadie (firebladsstadie) blev analyseret. Ekspressionsmønstrene under tørkestress blev omfattende analyseret for at give et videnskabeligt grundlag for yderligere undersøgelser af BjGRF-geners potentielle funktion i tørkerespons og for at tilvejebringe kandidatgener til avl af tørketolerant sennep.
Fireogtredive BjGRF-gener blev identificeret i Brassica juncea-genomet ved hjælp af to HMMER-søgninger, som alle indeholder QLQ- og WRC-domænerne. CDS-sekvenserne for de identificerede BjGRF-gener er præsenteret i Supplerende Tabel S1. BjGRF01-BjGRF34 er navngivet baseret på deres placering på kromosomet. De fysisk-kemiske egenskaber ved denne familie indikerer, at aminosyrelængden er meget variabel og spænder fra 261 aminosyrer (BjGRF19) til 905 aminosyrer (BjGRF28). Det isoelektriske punkt for BjGRF varierer fra 6,19 (BjGRF02) til 9,35 (BjGRF03) med et gennemsnit på 8,33, og 88,24% af BjGRF er et basisk protein. Det forudsagte molekylvægtinterval for BjGRF er fra 29,82 kDa (BjGRF19) til 102,90 kDa (BjGRF28); Instabilitetsindekset for BjGRF-proteiner varierer fra 51,13 (BjGRF08) til 78,24 (BjGRF19), alle er større end 40, hvilket indikerer, at fedtsyreindekset varierer fra 43,65 (BjGRF01) til 78,78 (BjGRF22), den gennemsnitlige hydrofilicitet (GRAVY) varierer fra -1,07 (BjGRF31) til -0,45 (BjGRF22), og alle de hydrofile BjGRF-proteiner har negative GRAVY-værdier, hvilket kan skyldes manglen på hydrofobicitet forårsaget af resterne. Subcellulær lokaliseringsforudsigelse viste, at 31 BjGRF-kodede proteiner kunne være lokaliseret i kernen, BjGRF04 kunne være lokaliseret i peroxisomer, BjGRF25 kunne være lokaliseret i cytoplasmaet, og BjGRF28 kunne være lokaliseret i kloroplaster (Tabel 1), hvilket indikerer, at BjGRF'er kan være lokaliseret i kernen og spille en vigtig regulatorisk rolle som en transkriptionsfaktor.
Fylogenetisk analyse af GRF-familier i forskellige arter kan hjælpe med at studere genfunktioner. Derfor blev aminosyresekvenserne i fuld længde fra 35 raps-, 16 majroe-, 12 ris-, 10 hirse- og 9 Arabidopsis-GRF'er downloadet, og et fylogenetisk træ blev konstrueret baseret på 34 identificerede BjGRF-gener (fig. 1). De tre underfamilier indeholder forskellige antal medlemmer; 116 GRF TF'er er opdelt i tre forskellige underfamilier (grupper A~C), der indeholder henholdsvis 59 (50,86%), 34 (29,31%) og 23 (19,83)% af GRF'erne. Blandt dem er 34 BjGRF-familiemedlemmer spredt over 3 underfamilier: 13 medlemmer i gruppe A (38,24%), 12 medlemmer i gruppe B (35,29%) og 9 medlemmer i gruppe C (26,47%). I processen med sennepspolyploidisering er antallet af BjGRF-gener i forskellige underfamilier forskelligt, og genamplifikation og -tab kan være forekommet. Det er værd at bemærke, at der ikke er nogen fordeling af ris- og hirse-GRF'er i gruppe C, mens der er 2 ris-GRF'er og 1 hirse-GRF i gruppe B, og de fleste ris- og hirse-GRF'er er grupperet i én gren, hvilket indikerer, at BjGRF'er er tæt beslægtede med tokimbladede planter. Blandt dem giver de mest dybdegående undersøgelser af GRF-funktionen i Arabidopsis thaliana grundlag for funktionelle studier af BjGRF'er.
Fylogenetisk sennepstræ, inklusive Brassica napus, Brassica napus, ris, hirse og medlemmer af Arabidopsis thaliana GRF-familien.
Analyse af repetitive gener i senneps-GRF-familien. Den grå linje i baggrunden repræsenterer en synkroniseret blok i sennepsgenomet, den røde linje repræsenterer et par segmenterede gentagelser af BjGRF-genet;
BjGRF-genekspression under tørkestress i fjerde bladstadium. qRT-PCR-data er vist i supplerende tabel S5. Signifikante forskelle i data er angivet med små bogstaver.
I takt med at det globale klima fortsætter med at ændre sig, er det blevet et varmt forskningsemne at studere, hvordan afgrøder håndterer tørkestress og forbedrer deres tolerancemekanismer18. Efter tørke vil planters morfologiske struktur, genekspression og metaboliske processer ændre sig, hvilket kan føre til ophør af fotosyntese og metaboliske forstyrrelser, hvilket påvirker afgrødernes udbytte og kvalitet19,20,21. Når planter registrerer tørkesignaler, producerer de sekundære budbringere såsom Ca2+ og phosphatidylinositol, øger den intracellulære calciumionkoncentration og aktiverer det regulatoriske netværk af proteinfosforyleringsvejen22,23. Det endelige målprotein er direkte involveret i cellulært forsvar eller regulerer ekspressionen af relaterede stressgener gennem TF'er, hvilket forbedrer planters tolerance over for stress24,25. TF'er spiller således en afgørende rolle i reaktionen på tørkestress. I henhold til sekvensen og DNA-bindingsegenskaberne hos tørkestress-responsive TF'er kan TF'er opdeles i forskellige familier, såsom GRF, ERF, MYB, WRKY og andre familier26.
GRF-genfamilien er en type plantespecifik TF, der spiller vigtige roller i forskellige aspekter såsom vækst, udvikling, signaltransduktion og planters forsvarsresponser27. Siden det første GRF-gen blev identificeret i O. sativa28, er flere og flere GRF-gener blevet identificeret i mange arter og vist at påvirke planters vækst, udvikling og stressrespons8, 29, 30,31,32. Med offentliggørelsen af Brassica juncea-genomsekvensen blev identifikationen af BjGRF-genfamilien mulig33. I denne undersøgelse blev 34 BjGRF-gener identificeret i hele sennepsgenomet og navngivet BjGRF01-BjGRF34 baseret på deres kromosomale position. Alle indeholder stærkt konserverede QLQ- og WRC-domæner. Analyse af de fysisk-kemiske egenskaber viste, at forskellene i aminosyreantal og molekylvægte af BjGRF-proteinerne (undtagen BjGRF28) ikke var signifikante, hvilket indikerer, at medlemmerne af BjGRF-familien kan have lignende funktioner. Genstrukturanalyse viste, at 64,7% af BjGRF-generne indeholdt 4 exoner, hvilket indikerer, at BjGRF-genstrukturen er relativt bevaret i evolutionen, men antallet af exoner i BjGRF10-, BjGRF16-, BjGRP28- og BjGRF29-generne er større. Studier har vist, at tilføjelse eller sletning af exoner eller introner kan føre til forskelle i genstruktur og -funktion og derved skabe nye gener34,35,36. Derfor spekulerer vi i, at intronen i BjGRF gik tabt under evolutionen, hvilket kan forårsage ændringer i genfunktionen. I overensstemmelse med eksisterende studier fandt vi også, at antallet af introner var forbundet med genekspression. Når antallet af introner i et gen er stort, kan genet hurtigt reagere på forskellige ugunstige faktorer.
Genduplikation er en vigtig faktor i genomisk og genetisk evolution37. Relaterede undersøgelser har vist, at genduplikering ikke kun øger antallet af GRF-gener, men også fungerer som et middel til at generere nye gener, der hjælper planter med at tilpasse sig forskellige ugunstige miljøforhold38. I alt 48 duplikerede genpar blev fundet i denne undersøgelse, som alle var segmentale duplikationer, hvilket indikerer, at segmentale duplikationer er den vigtigste mekanisme til at øge antallet af gener i denne familie. Det er blevet rapporteret i litteraturen, at segmental duplikation effektivt kan fremme amplifikationen af GRF-genfamiliemedlemmer i Arabidopsis og jordbær, og der blev ikke fundet tandemduplikation af denne genfamilie i nogen af arterne27,39. Resultaterne af denne undersøgelse er i overensstemmelse med eksisterende undersøgelser af Arabidopsis thaliana og jordbærfamilier, hvilket tyder på, at GRF-familien kan øge antallet af gener og generere nye gener gennem segmental duplikation i forskellige planter.
I denne undersøgelse blev i alt 34 BjGRF-gener identificeret i sennep, som blev opdelt i 3 underfamilier. Disse gener udviste lignende konserverede motiver og genstrukturer. Kollinearitetsanalyse afslørede 48 par segmentduplikationer i sennep. BjGRF-promotorregionen indeholder cis-virkende elementer forbundet med lysrespons, hormonrespons, miljømæssig stressrespons samt vækst og udvikling. Ekspressionen af 34 BjGRF-gener blev detekteret i sennepsfrøplantestadiet (rødder, stængler, blade), og ekspressionsmønsteret for 10 BjGRF-gener under tørkeforhold blev detekteret. Det blev fundet, at ekspressionsmønstrene for BjGRF-gener under tørkestress var ens og kan være ens. BjGRF03- og BjGRF32-gener kan spille positive regulatoriske roller i tørkestress, mens BjGRF06 og BjGRF23 spiller roller i tørkestress som miR396-målgener. Samlet set giver vores undersøgelse et biologisk grundlag for fremtidig opdagelse af BjGRF-genfunktionen i Brassicaceae-planter.
Sennepsfrøene, der blev brugt i dette eksperiment, blev leveret af Guizhou Oil Seed Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences. Udvælg de hele frø og plant dem i jord (substrat: jord = 3:1), og opsaml rødder, stængler og blade efter firbladsstadiet. Planterne blev behandlet med 20% PEG 6000 for at simulere tørke, og bladene blev opsamlet efter 0, 3, 6, 12 og 24 timer. Alle planteprøver blev straks frosset i flydende nitrogen og derefter opbevaret i en -80°C fryser til den næste test.
Alle data, der er indhentet eller analyseret i løbet af dette studie, er inkluderet i den publicerede artikel og i de supplerende informationsfiler.
Opslagstidspunkt: 22. januar 2025