Fyrre-nematoden er en karantænevandrende endoparasit, der er kendt for at forårsage alvorlige økonomiske tab i fyrreskovens økosystemer. Denne undersøgelse gennemgår den nematicide aktivitet af halogenerede indoler mod fyrre-nematoder og deres virkningsmekanisme. De nematicide aktiviteter af 5-iodoindol og avermectin (positiv kontrol) mod fyrre nematoder var ens og høje ved lave koncentrationer (10 μg/mL). 5-iodoindol reduceret frugtbarhed, reproduktiv aktivitet, embryonal og larvedødelighed og bevægelsesadfærd. Molekylær interaktion af ligander med hvirvelløse dyr-specifikke glutamat-gatede chloridkanalreceptorer understøtter forestillingen om, at 5-iodoindol, ligesom avermectin, binder tæt til receptorens aktive sted. 5-iodoindol inducerede også forskellige fænotypiske deformationer i nematoder, herunder unormalt organkollaps/krympning og øget vakuolisering. Disse resultater tyder på, at vakuoler kan spille en rolle i nematodemethyleringsmedieret død. Det er vigtigt, at 5-iodoindol var ugiftigt for begge plantearter (kål og radise). Således viser denne undersøgelse, at iodoindol-anvendelse under miljømæssige forhold kan kontrollere fyrrevisneskade.
Fyrretrænematode (Bursaphelenchus xylophilus) tilhører fyrreskovnematoder (PWN), vandrende endoparasitiske nematoder, der vides at forårsage alvorlige økologiske skader på fyrreskovens økosystemer1. Fyrrevisnesygdom (PWD) forårsaget af fyrreskovnematoden er ved at blive et alvorligt problem på flere kontinenter, herunder Asien og Europa, og i Nordamerika ødelægger nematoden indførte fyrrearter1,2. Nedgang i fyrretræer er et stort økonomisk problem, og udsigten til dens globale spredning er bekymrende3. Følgende fyrrearter angribes oftest af nematoden: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii og Pinus radiata4. Fyrrenematode er en alvorlig sygdom, der kan dræbe fyrretræer inden for uger eller måneder efter infektion. Derudover er udbrud af fyrre-nematoder almindelige i en række forskellige økosystemer, så der er etableret vedvarende infektionskæder1.
Bursaphelenchus xylophilus er en karantæne plante-parasitisk nematode, der tilhører overfamilien Aphelenchoidea og clade 102.5. Nematoden lever af svampe og formerer sig i fyrretræernes trævæv og udvikler sig til fire forskellige larvestadier: L1, L2, L3, L4 og et voksent individ1,6. Under forhold med fødemangel går fyrre-nematoden over i et specialiseret larvestadium - dauer, som snylter sin vektor - fyrrebarkbillen (Monochamus alternatus) og overføres til sunde fyrretræer. Hos raske værter migrerer nematoder hurtigt gennem plantevæv og lever af parenchymatøse celler, hvilket fører til en række overfølsomhedsreaktioner, fyrrevisnning og død inden for et år efter infektion1,7,8.
Biologisk bekæmpelse af fyrre-nematoder har længe været en udfordring, med karantæneforanstaltninger, der går tilbage til det 20. århundrede. Nuværende strategier til bekæmpelse af fyrre-nematoder involverer primært kemiske behandlinger, herunder trægasning og implantation af nematicider i træstammer. De mest almindeligt anvendte nematicider er avermectin og avermectinbenzoat, som tilhører avermectin-familien. Disse dyre kemikalier er yderst effektive mod mange nematodearter og anses for at være miljøvenlige9. Gentagen brug af disse nematicider forventes dog at skabe et selektionspres, der næsten helt sikkert vil føre til fremkomsten af resistente fyrre-nematoder, som det er blevet påvist for adskillige skadedyr, såsom Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella og nematoderne Trichostrongylus colubriformis og Ostertagia circum, der har udviklet resistens mod graducinacta. avermectiner10,11,12. Derfor skal resistensmønstre regelmæssigt undersøges og nematicider screenes løbende for at finde alternative, omkostningseffektive og miljøvenlige foranstaltninger til at kontrollere PVD. I de seneste årtier har en række forfattere foreslået brugen af planteekstrakter, æteriske olier og flygtige stoffer som nematodekontrolmidler13,14,15,16.
Vi har for nylig demonstreret den nematicide aktivitet af indol, et intercellulært og interkingdom-signalmolekyle, i Caenorhabditis elegans 17 . Indol er et udbredt intracellulært signal i mikrobiel økologi, der kontrollerer adskillige funktioner, der påvirker mikrobiel fysiologi, sporedannelse, plasmidstabilitet, lægemiddelresistens, biofilmdannelse og virulens 18, 19 . Aktiviteten af indol og dets derivater mod andre patogene nematoder er ikke blevet undersøgt. I denne undersøgelse undersøgte vi den nematicide aktivitet af 34 indoler mod fyrre-nematoder og belyste virkningsmekanismen af den mest potente 5-iodoindol ved hjælp af mikroskopi, time-lapse fotografering og molekylære docking-eksperimenter og vurderede dens toksiske virkninger på planter ved hjælp af et frøspiringsassay.
Høje koncentrationer (>1,0 mM) af indol er tidligere blevet rapporteret at have en nematicid effekt på nematoder17. Efter behandling af B. xylophilus (blandede livsstadier) med indol eller 33 forskellige indolderivater ved 1 mM, blev dødeligheden af B. xylophilus målt ved at tælle levende og døde nematoder i kontrol- og behandlede grupper. Fem indoler udviste signifikant nematicid aktivitet; overlevelsen af den ubehandlede kontrolgruppe var 95 ± 7 % efter 24 timer. Af de 34 testede indoler forårsagede 5-iodoindol og 4-fluorindol ved 1 mM 100 % dødelighed, hvorimod 5,6-difluorindigo, methylindol-7-carboxylat og 7-iodoindol forårsagede ca. 50 % dødelighed (tabel 1).
Effekt af 5-iodoindol på vakuoldannelse og metabolisme af fyrrevednematoder. (A) Effekt af avermectin og 5-iodoindol på voksne hannematoder, (B) L1-stadium nematodeæg og (C) metabolisme af B. xylophilus, (i) vakuoler blev ikke observeret efter 0 timer, behandling resulterede i (ii) vakuoler, (iii) akkumulering af multiple vakuoler, (iv) fusion af vacuoler, (iv) fusion af vacuoler vakuoler og (vi) dannelse af gigantiske vakuoler. Røde pile indikerer hævelse af vakuoler, blå pile indikerer fusion af vakuoler og sorte pile indikerer kæmpe vakuoler. Målestok = 50 μm.
Derudover beskrev denne undersøgelse også den sekventielle proces med methan-induceret død i fyrre nematoder (figur 4C). Methanogen død er en ikke-apoptotisk type celledød forbundet med akkumulering af fremtrædende cytoplasmatiske vakuoler27. De morfologiske defekter observeret i fyrre-nematoder ser ud til at være nært beslægtede med mekanismen for metan-induceret død. Mikroskopisk undersøgelse på forskellige tidspunkter viste, at gigantiske vakuoler blev dannet efter 20 timers eksponering for 5-iodoindol (0,1 mM). Mikroskopiske vakuoler blev observeret efter 8 timers behandling, og deres antal steg efter 12 timer. Flere store vakuoler blev observeret efter 14 timer. Adskillige fusionerede vakuoler var tydeligt synlige efter 12-16 timers behandling, hvilket indikerer, at vakuolefusion er grundlaget for den methanogene dødsmekanisme. Efter 20 timer blev der fundet adskillige gigantiske vakuoler i hele ormen. Disse observationer repræsenterer den første rapport om metuose hos C. elegans.
Hos 5-iodoindol-behandlede orme blev vakuoleaggregering og brud også observeret (fig. 5), som det fremgår af ormebøjning og vakuolefrigivelse til miljøet. Vakuoleafbrydelse blev også observeret i æggeskalsmembranen, som normalt bevares intakt af L2 under udklækningen (Supplerende Fig. S2). Disse observationer understøtter involvering af væskeakkumulering og osmoregulatorisk svigt, såvel som reversibel celleskade (RCI), i processen med vakuoledannelse og suppuration (fig. 5).
Med en hypotese om jods rolle i den observerede vakuoldannelse undersøgte vi den nematicide aktivitet af natriumiodid (NaI) og kaliumiodid (KI). Ved koncentrationer (0,1, 0,5 eller 1 mM) påvirkede de dog hverken nematodeoverlevelse eller vakuoledannelse (Supplerende Fig. S5), selvom 1 mM KI havde en let nematicid effekt. På den anden side inducerede 7-iodoindol (1 eller 2 mM), ligesom 5-iodoindol, flere vakuoler og strukturelle deformationer (Supplerende Fig. S6). De to iodindoler viste lignende fænotypiske egenskaber i fyrre-nematoder, hvorimod NaI og KI ikke gjorde det. Interessant nok inducerede indol ikke vakuoldannelse i B. xylophilus ved de testede koncentrationer (data ikke vist). Resultaterne bekræftede således, at indol-jod-komplekset er ansvarligt for vakuoliseringen og metabolismen af B. xylophilus.
Blandt de indoler, der blev testet for nematicid aktivitet, havde 5-iodoindol det højeste glideindeks på -5,89 kcal/mol, efterfulgt af 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindol (-4,33) og indol (-4,03) (figur 6). Den stærke rygradshydrogenbinding af 5-iodoindol til leucin 218 stabiliserer dens binding, hvorimod alle andre indolderivater binder til serin 260 via sidekædehydrogenbindinger. Blandt andre modellerede iodoindoler har 2-iodoindol en bindingsværdi på -5,248 kcal/mol, hvilket skyldes dets primære hydrogenbinding med leucin 218. Andre kendte bindinger omfatter 3-iodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindol (-4,0 kcal/mol. figur S8). De fleste halogenerede indoler og indol selv, med undtagelse af 5-iodoindol og 2-iodoindol, danner en binding med serin 260. Den kendsgerning, at hydrogenbinding med leucin 218 indikerer effektiv receptor-ligandbinding, som observeret for ivermectin (Supplerende Fig. S7), bekræfter, at 5-iodoindol, iodoindol, 5 ivermectin, binder tæt til det aktive sted af GluCL-receptoren via leucin 218 (fig. 6 og supplerende fig. S8). Vi foreslår, at denne binding er nødvendig for at opretholde den åbne porestruktur af GluCL-komplekset, og at 5-iodoindol, 2-iodoindol, avermectin og ivermectin ved tæt binding til det aktive sted af GluCL-receptoren holder ionkanalen åben og tillader væskeoptagelse.
Molekylær docking af indol og halogeneret indol til GluCL. Bindingsorienteringer af (A) indol, (B) 4-fluorindol, (C) 7-iodoindol, og (D) 5-iodoindol ligander til det aktive sted af GluCL. Proteinet er repræsenteret af et bånd, og rygradshydrogenbindingerne er vist som gule stiplede linjer. (A′), (B′), (C′) og (D′) viser interaktionerne af de tilsvarende ligander med de omgivende aminosyrerester, og sidekæde-hydrogenbindingerne er angivet med lyserøde prikkede pile.
Eksperimenter blev udført for at evaluere den toksiske virkning af 5-iodoindol på spiringen af kål- og radisefrø. 5-iodoindol (0,05 eller 0,1 mM) eller avermectin (10 μg/mL) havde ringe eller ingen effekt på initial spiring og fremkomst af småplanter (figur 7). Derudover blev der ikke fundet nogen signifikant forskel mellem spirehastigheden af ubehandlede kontroller og frø behandlet med 5-iodoindol eller avermectin. Effekten på pælerodsforlængelsen og antallet af dannede siderødder var ubetydelig, selvom 1 mM (10 gange dens aktive koncentration) af 5-iodoindol forsinkede udviklingen af siderødder en smule. Disse resultater indikerer, at 5-iodoindol er ikke-toksisk for planteceller og ikke interfererer med planteudviklingsprocesser ved de undersøgte koncentrationer.
Effekt af 5-iodoindol på frøspiring. Spiring, spiring og lateral roddannelse af B. oleracea og R. raphanistrum frø på Murashige og Skoog agar medium med eller uden avermectin eller 5-iodoindol. Spiring blev registreret efter 3 dages inkubation ved 22°C.
Denne undersøgelse rapporterer flere tilfælde af nematodedrab af indoler. Det er vigtigt, at dette er den første rapport om iodindol-inducerende methylering (en proces forårsaget af ophobning af små vakuoler, der gradvist smelter sammen i gigantiske vakuoler, hvilket i sidste ende fører til membransprængning og død) i fyrrenåle, hvor iodindol udviser betydelige nematicide egenskaber svarende til dem af det kommercielle nemainticid-avermektid.
Indoler er tidligere blevet rapporteret at udøve flere signalfunktioner i prokaryoter og eukaryoter, herunder biofilmhæmning/dannelse, bakteriel overlevelse og patogenicitet19,32,33,34. For nylig har de potentielle terapeutiske virkninger af halogenerede indoler, indolalkaloider og semisyntetiske indolderivater tiltrukket omfattende forskningsinteresse35,36,37. For eksempel har halogenerede indoler vist sig at dræbe vedvarende Escherichia coli- og Staphylococcus aureus-celler37. Derudover er det af videnskabelig interesse at studere effekten af halogenerede indoler mod andre arter, slægter og kongeriger, og denne undersøgelse er et skridt i retning af at nå dette mål.
Her foreslår vi en mekanisme for 5-iodoindol-induceret dødelighed i C. elegans baseret på reversibel celleskade (RCI) og methylering (figur 4C og 5). Ødematøse ændringer såsom hævelser og vakuolær degeneration er indikatorer for RCI og methylering, manifesteret som gigantiske vakuoler i cytoplasmaet48,49. RCI interfererer med energiproduktionen ved at reducere ATP-produktionen, forårsage svigt af ATPase-pumpen eller forstyrre cellemembraner og forårsage en hurtig tilstrømning af Na+, Ca2+ og vand50,51,52. Intracytoplasmatiske vakuoler opstår i dyreceller som følge af væskeophobning i cytoplasmaet på grund af tilstrømningen af Ca2+ og vand53. Interessant nok er denne mekanisme for celleskade reversibel, hvis skaden er midlertidig, og cellerne begynder at producere ATP i en vis periode, men hvis skaden fortsætter eller forværres, dør cellerne.54 Vores observationer viser, at nematoder behandlet med 5-iodoindol ikke er i stand til at genoprette normal biosyntese efter udsættelse for stresstilstande.
Methyleringsfænotypen induceret af 5-iodoindol i B. xylophilus kan skyldes tilstedeværelsen af jod og dets molekylære fordeling, da 7-iodoindol havde mindre hæmmende effekt på B. xylophilus end 5-iodoindol (tabel 1 og supplerende figur S6). Disse resultater er delvist i overensstemmelse med undersøgelserne af Maltese et al. (2014), som rapporterede, at translokation af pyridylnitrogendelen i indol fra para- til metapositionen ophævede vakuolisering, væksthæmning og cytotoksicitet i U251-celler, hvilket tyder på, at interaktionen af molekylet med et specifikt aktivt sted i proteinet er kritisk27,44,45. Interaktionerne mellem indol eller halogenerede indoler og GluCL-receptorer observeret i denne undersøgelse understøtter også denne opfattelse, da 5- og 2-iodoindol blev fundet at binde til GluCL-receptorer stærkere end de andre undersøgte indoler (Figur 6 og Supplerende Figur S8). Jodet i den anden eller femte position af indolen blev fundet at binde til leucin 218 af GluCL-receptoren via rygradshydrogenbindinger, hvorimod andre halogenerede indoler og indol selv danner svage sidekæde-hydrogenbindinger med serin 260 (figur 6). Vi spekulerer derfor i, at lokaliseringen af halogenet spiller en vigtig rolle i induktionen af vakuolær degeneration, hvorimod den tætte binding af 5-iodoindol holder ionkanalen åben og derved tillader hurtig væsketilstrømning og vakuolbrud. Den detaljerede virkningsmekanisme af 5-iodoindol mangler dog at blive bestemt.
Før praktisk anvendelse af 5-iodoindol bør dets toksiske virkning på planter analyseres. Vores frøspiringseksperimenter viste, at 5-iodoindol ikke havde nogen negativ effekt på frøspiring eller efterfølgende udviklingsprocesser ved de undersøgte koncentrationer (figur 7). Dette studie giver således grundlag for anvendelsen af 5-iodoindol i det økologiske miljø til at kontrollere fyrre-nematoders skadelighed for fyrretræer.
Tidligere rapporter har vist, at indolbaseret terapi repræsenterer en potentiel tilgang til at løse problemet med antibiotikaresistens og cancerprogression55. Derudover har indoler antibakterielle, anticancer-, antioxidant-, anti-inflammatoriske, antidiabetiske, antivirale, antiproliferative og antituberkulose-aktiviteter og kan tjene som et lovende grundlag for lægemiddeludvikling56,57. Denne undersøgelse antyder for første gang den potentielle brug af jod som et antiparasitisk og anthelmintisk middel.
Avermectin blev opdaget for tre årtier siden og vandt Nobelprisen i 2015, og dets brug som anthelmintikum er stadig aktivt i gang. Men på grund af den hurtige udvikling af resistens over for avermectiner i nematoder og skadedyr, er der behov for en alternativ, billig og miljøvenlig strategi til at kontrollere PWN-infektion i fyrretræer. Denne undersøgelse rapporterer også den mekanisme, hvorved 5-iodoindol dræber fyrre-nematoder, og at 5-iodoindol har lav toksicitet over for planteceller, hvilket åbner op for gode udsigter for dets fremtidige kommercielle anvendelse.
Alle eksperimenter blev godkendt af den etiske komité på Yeungnam University, Gyeongsan, Korea, og metoderne blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Yeungnam Universitys etiske komité.
Æggeinkubationsforsøg blev udført ved hjælp af etablerede procedurer43. For at vurdere klækningshastigheder (HR) blev 1 dag gamle voksne nematoder (ca. 100 hunner og 100 hanner) overført til petriskåle indeholdende svampen og fik lov til at vokse i 24 timer. Æg blev derefter isoleret og behandlet med 5-iodoindol (0,05 mM og 0,1 mM) eller avermectin (10 μg/ml) som en suspension i sterilt destilleret vand. Disse suspensioner (500 μl; ca. 100 æg) blev overført til brøndene på en 24-brønds vævskulturplade og inkuberet ved 22 °C. L2-tællinger blev foretaget efter 24 timers inkubation, men blev betragtet som døde, hvis cellerne ikke bevægede sig, når de blev stimuleret med en fin platintråd. Dette eksperiment blev udført i to trin, hver med seks gentagelser. Data fra begge forsøg blev kombineret og præsenteret. Procentdelen af HR beregnes som følger:
Larvedødelighed blev vurderet ved hjælp af tidligere udviklede procedurer. Nematodeæg blev opsamlet, og embryoner blev synkroniseret ved udklækning i sterilt destilleret vand for at generere L2-stadielarver. Synkroniserede larver (ca. 500 nematoder) blev behandlet med 5-iodoindol (0,05 mM og 0,1 mM) eller avermectin (10 μg/ml) og opdrættet på B. cinerea Petri-plader. Efter 48 timers inkubation ved 22 °C blev nematoder opsamlet i sterilt destilleret vand og undersøgt for tilstedeværelsen af L2-, L3- og L4-stadier. Tilstedeværelsen af L3- og L4-stadier indikerede larvetransformation, hvorimod tilstedeværelsen af L2-stadiet indikerede ingen transformation. Billeder blev erhvervet ved hjælp af iRiS™ Digital Cell Imaging System. Dette eksperiment blev udført i to trin, hver med seks gentagelser. Data fra begge forsøg blev kombineret og præsenteret.
Toksiciteten af 5-iodoindol og avermectin over for frø blev vurderet ved hjælp af spireforsøg på Murashige og Skoog agarplader.62 B. oleracea og R. raphanistrum frø blev først gennemblødt i sterilt destilleret vand i en dag, vasket med 1 ml 100% til kommerciel ethanol, steriliseret med natriumhypoklorit 50% 1 ml blegemiddel (50% 1 ml) 15 min, og vasket fem gange med 1 ml sterilt vand. De steriliserede frø blev derefter presset på spiringsagarplader indeholdende 0,86 g/l (0,2X) Murashige og Skoog medium og 0,7% bakteriologisk agar med eller uden 5-iodoindol eller avermectin. Pladerne blev derefter inkuberet ved 22 °C, og billeder blev taget efter 3 dages inkubation. Dette eksperiment blev udført i to faser, som hver havde seks gentagelser.
Indlægstid: 26-2-2025