Fyrrenematoden er en karantænemigrerende endoparasit, der er kendt for at forårsage alvorlige økonomiske tab i fyrreskovsøkosystemer. Denne undersøgelse gennemgår den nematicidale aktivitet af halogenerede indoler mod fyrrenematoder og deres virkningsmekanisme. De nematicidale aktiviteter af 5-iodoindol og avermectin (positiv kontrol) mod fyrrenematoder var ens og høje ved lave koncentrationer (10 μg/ml). 5-iodoindol reducerede frugtbarhed, reproduktionsaktivitet, embryonal og larvedødelighed samt bevægelsesadfærd. Molekylære interaktioner mellem ligander og hvirvelløse-specifikke glutamatstyrede kloridkanalreceptorer understøtter antagelsen om, at 5-iodoindol, ligesom avermectin, binder tæt til receptorens aktive sted. 5-iodoindol inducerede også forskellige fænotypiske deformationer i nematoder, herunder unormal organkollaps/krympning og øget vakuolisering. Disse resultater tyder på, at vakuoler kan spille en rolle i nematodemethyleringsmedieret død. Det er vigtigt at bemærke, at 5-iodoindol ikke var giftig for begge plantearter (kål og radise). Denne undersøgelse viser således, at anvendelse af iodoindol under miljømæssige forhold kan kontrollere visnesygeskader fra fyrretræer.
Fyrretræsnematoden (Bursaphelenchus xylophilus) tilhører fyrretræsnematoderne (PWN), migrerende endoparasitiske nematoder, der er kendt for at forårsage alvorlig økologisk skade på fyrreskovsøkosystemer1. Fyrretræsvisnesyge (PWD) forårsaget af fyrretræsnematoden er ved at blive et alvorligt problem på flere kontinenter, herunder Asien og Europa, og i Nordamerika ødelægger nematoden introducerede fyrretræarter1,2. Nedgang i fyrretræsbefolkningen er et stort økonomisk problem, og udsigten til dens globale spredning er bekymrende3. Følgende fyrretræarter angribes oftest af nematoden: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii og Pinus radiata4. Fyrretræsnematoden er en alvorlig sygdom, der kan dræbe fyrretræer inden for uger eller måneder efter infektion. Derudover er udbrud af fyrretræsnematoder almindelige i en række forskellige økosystemer, så der er etableret vedvarende infektionskæder1.
Bursaphelenchus xylophilus er en karantæne planteparasitisk nematode, der tilhører superfamilien Aphelenchoidea og klade 102.5. Nematoden lever af svampe og formerer sig i fyrretræers trævæv og udvikler sig til fire forskellige larvestadier: L1, L2, L3, L4 og et voksent individ1,6. Under fødemangel går fyrretræsnematoden over i et specialiseret larvestadium – dauer, som parasiterer sin vektor – fyrrebarkbillen (Monochamus alternatus) og overføres til sunde fyrretræer. Hos sunde værter migrerer nematoder hurtigt gennem plantevæv og lever af parenkymceller, hvilket fører til en række overfølsomhedsreaktioner, fyrretræets visnen og død inden for et år efter infektion1,7,8.
Biologisk bekæmpelse af fyrretræsnematoder har længe været en udfordring, med karantæneforanstaltninger, der går tilbage til det 20. århundrede. Nuværende strategier til bekæmpelse af fyrretræsnematoder involverer primært kemiske behandlinger, herunder trægasning og implantation af nematodicider i træstammer. De mest almindeligt anvendte nematodicider er avermectin og avermectinbenzoat, som tilhører avermectinfamilien. Disse dyre kemikalier er yderst effektive mod mange nematodearter og betragtes som miljøvenlige9. Gentagen brug af disse nematodicider forventes dog at skabe et selektionspres, der næsten helt sikkert vil føre til fremkomsten af resistente fyrretræsnematoder, som det er blevet påvist for adskillige insektskadedyr, såsom Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella og nematoderne Trichostrongylus colubriformis og Ostertagia circumcincta, som gradvist har udviklet resistens over for avermectiner10,11,12. Derfor skal resistensmønstre undersøges regelmæssigt, og nematicider skal screenes løbende for at finde alternative, omkostningseffektive og miljøvenlige foranstaltninger til at bekæmpe PVD. I de seneste årtier har en række forfattere foreslået brugen af planteekstrakter, æteriske olier og flygtige stoffer som nematodebekæmpelsesmidler13,14,15,16.
Vi har for nylig demonstreret den nematicidale aktivitet af indol, et intercellulært og interkongeriges signalmolekyle, i Caenorhabditis elegans 17. Indol er et udbredt intracellulært signal i mikrobiel økologi, der kontrollerer adskillige funktioner, der påvirker mikrobiel fysiologi, sporedannelse, plasmidstabilitet, lægemiddelresistens, biofilmdannelse og virulens 18, 19. Aktiviteten af indol og dets derivater mod andre patogene nematoder er ikke blevet undersøgt. I denne undersøgelse undersøgte vi den nematicidale aktivitet af 34 indoler mod fyrretræsnematoder og belyste virkningsmekanismen for den mest potente 5-iodindol ved hjælp af mikroskopi, time-lapse-fotografering og molekylære dockingeksperimenter, og vurderede dens toksiske virkninger på planter ved hjælp af et frøspiringsassay.
Høje koncentrationer (>1,0 mM) af indol har tidligere vist sig at have en nematodedræbende effekt på nematoder17. Efter behandling af B. xylophilus (blandede livsstadier) med indol eller 33 forskellige indolderivater ved 1 mM blev dødeligheden af B. xylophilus målt ved at tælle levende og døde nematoder i kontrol- og behandlede grupper. Fem indoler udviste signifikant nematodedræbende aktivitet; overlevelsen af den ubehandlede kontrolgruppe var 95 ± 7% efter 24 timer. Af de 34 testede indoler forårsagede 5-iodoindol og 4-fluorindol ved 1 mM 100% dødelighed, hvorimod 5,6-difluorindigo, methylindol-7-carboxylat og 7-iodoindol forårsagede ca. 50% dødelighed (Tabel 1).
Effekt af 5-iodoindol på vakuoldannelse og metabolisme af fyrretræsnematoder. (A) Effekt af avermectin og 5-iodoindol på voksne hannematoder, (B) L1-stadie nematodeæg og (C) metabolisme af B. xylophilus, (i) vakuoler blev ikke observeret ved 0 timer, behandling resulterede i (ii) vakuoler, (iii) akkumulering af flere vakuoler, (iv) hævelse af vakuoler, (v) fusion af vakuoler og (vi) dannelse af kæmpevakuoler. Røde pile indikerer hævelse af vakuoler, blå pile indikerer fusion af vakuoler, og sorte pile indikerer kæmpevakuoler. Skala = 50 μm.
Derudover beskrev denne undersøgelse også den sekventielle proces med metaninduceret død i fyrretræsnematoder (Figur 4C). Metanogen død er en ikke-apoptotisk type celledød forbundet med akkumulering af fremtrædende cytoplasmatiske vakuoler27. De morfologiske defekter observeret i fyrretræsnematoder synes at være tæt forbundet med mekanismen for metaninduceret død. Mikroskopisk undersøgelse på forskellige tidspunkter viste, at kæmpevakuoler blev dannet efter 20 timers eksponering for 5-iodoindol (0,1 mM). Mikroskopiske vakuoler blev observeret efter 8 timers behandling, og deres antal steg efter 12 timer. Adskillige store vakuoler blev observeret efter 14 timer. Adskillige sammenvoksede vakuoler var tydeligt synlige efter 12-16 timers behandling, hvilket indikerer, at vakuolfusion er grundlaget for den metanogene dødsmekanisme. Efter 20 timer blev der fundet adskillige kæmpevakuoler i hele ormen. Disse observationer repræsenterer den første rapport om metuose i C. elegans.
I orme behandlet med 5-iodoindol blev der også observeret vakuolaggregation og -ruptur (fig. 5), hvilket fremgår af ormebøjning og vakuolfrigivelse til miljøet. Vakuolbrud blev også observeret i æggeskallens membran, som normalt bevares intakt af L2 under klækning (supplerende fig. S2). Disse observationer understøtter involveringen af væskeophobning og osmoregulatorisk svigt, såvel som reversibel celleskade (RCI), i processen med vakuoldannelse og suppuration (fig. 5).
Ved at opstille en hypotese om jods rolle i den observerede vakuoldannelse undersøgte vi den nematicide aktivitet af natriumiodid (NaI) og kaliumiodid (KI). Ved koncentrationer (0,1, 0,5 eller 1 mM) påvirkede de dog ikke hverken nematodeoverlevelse eller vakuoldannelse (Supplerende Fig. S5), selvom 1 mM KI havde en let nematicid effekt. På den anden side inducerede 7-iodindol (1 eller 2 mM), ligesom 5-iodindol, flere vakuoler og strukturelle deformationer (Supplerende Fig. S6). De to iodindoler udviste lignende fænotypiske egenskaber i fyrretræsnematoder, hvorimod NaI og KI ikke gjorde. Interessant nok inducerede indol ikke vakuoldannelse i B. xylophilus ved de testede koncentrationer (data ikke vist). Resultaterne bekræftede således, at indol-iod-komplekset er ansvarligt for vakuoliseringen og metabolismen af B. xylophilus.
Blandt de indoler, der blev testet for nematicid aktivitet, havde 5-iodoindol det højeste slipindeks på -5,89 kcal/mol, efterfulgt af 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindol (-4,33) og indol (-4,03) (figur 6). Den stærke hydrogenbinding i rygraden af 5-iodoindol til leucin 218 stabiliserer dens binding, hvorimod alle andre indolderivater binder til serin 260 via sidekædehydrogenbindinger. Blandt andre modellerede iodoindoler har 2-iodoindol en bindingsværdi på -5,248 kcal/mol, hvilket skyldes dets primære hydrogenbinding med leucin 218. Andre kendte bindinger omfatter 3-iodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindol (-4,0 kcal/mol) og 6-fluorindol (-2,6 kcal/mol) (Supplerende figur S8). De fleste halogenerede indoler og selve indolen, med undtagelse af 5-iodindol og 2-iodindol, danner en binding med serin 260. Det faktum, at hydrogenbinding med leucin 218 er indikativ for effektiv receptor-ligandbinding, som observeret for ivermectin (supplerende figur S7), bekræfter, at 5-iodindol og 2-iodindol, ligesom ivermectin, binder tæt til det aktive sted på GluCL-receptoren via leucin 218 (figur 6 og supplerende figur S8). Vi foreslår, at denne binding er nødvendig for at opretholde den åbne porestruktur i GluCL-komplekset, og at 5-iodindol, 2-iodindol, avermectin og ivermectin ved at binde tæt til det aktive sted på GluCL-receptoren, således holder ionkanalen åben og tillader væskeoptagelse.
Molekylær docking af indol og halogeneret indol til GluCL. Bindingsorienteringer af (A) indol-, (B) 4-fluorindol-, (C) 7-iodoindol- og (D) 5-iodoindol-ligander til det aktive sted i GluCL. Proteinet er repræsenteret af et bånd, og rygradens hydrogenbindinger er vist som gule stiplede linjer. (A′), (B′), (C′) og (D′) viser interaktionerne mellem de tilsvarende ligander og de omgivende aminosyrerester, og sidekædens hydrogenbindinger er angivet med lyserøde stiplede pile.
Der blev udført eksperimenter for at evaluere den toksiske effekt af 5-iodoindol på spiringen af kål- og radisefrø. 5-iodoindol (0,05 eller 0,1 mM) eller avermectin (10 μg/ml) havde ringe eller ingen effekt på den indledende spiring og fremspiring af småplanter (figur 7). Derudover blev der ikke fundet nogen signifikant forskel mellem spirehastigheden for ubehandlede kontrolfrø og frø behandlet med 5-iodoindol eller avermectin. Effekten på forlængelse af pælerod og antallet af dannede siderødder var ubetydelig, selvom 1 mM (10 gange dens aktive koncentration) af 5-iodoindol forsinkede udviklingen af siderødder en smule. Disse resultater indikerer, at 5-iodoindol er ugiftigt for planteceller og ikke interfererer med planteudviklingsprocesser ved de undersøgte koncentrationer.
Effekt af 5-iodindol på frøspiring. Spiring, fremspiring og lateral rodning af B. oleracea- og R. raphanistrum-frø på Murashige- og Skoog-agarmedium med eller uden avermectin eller 5-iodindol. Spiring blev registreret efter 3 dages inkubation ved 22°C.
Denne undersøgelse rapporterer adskillige tilfælde af nematodedræbning forårsaget af indoler. Det er vigtigt at bemærke, at dette er den første rapport om iodoindol-inducerende methylering (en proces forårsaget af akkumulering af små vakuoler, der gradvist smelter sammen til gigantiske vakuoler, hvilket i sidste ende fører til membranbrud og død) i fyrrenåle, hvor iodoindol udviser betydelige nematicide egenskaber svarende til dem, der findes hos det kommercielle nematicid avermectin.
Det er tidligere rapporteret, at indoler udøver flere signalfunktioner i prokaryoter og eukaryoter, herunder biofilmhæmning/dannelse, bakteriel overlevelse og patogenicitet19,32,33,34. For nylig har de potentielle terapeutiske virkninger af halogenerede indoler, indolalkaloider og semisyntetiske indolderivater tiltrukket sig omfattende forskningsinteresse35,36,37. For eksempel har halogenerede indoler vist sig at dræbe persistente Escherichia coli- og Staphylococcus aureus-celler37. Derudover er det af videnskabelig interesse at studere effekten af halogenerede indoler mod andre arter, slægter og kongeriger, og denne undersøgelse er et skridt i retning af at nå dette mål.
Her foreslår vi en mekanisme for 5-iodoindol-induceret dødelighed i C. elegans baseret på reversibel celleskade (RCI) og methylering (figur 4C og 5). Ødematøse forandringer såsom hævelser og vakuolær degeneration er indikatorer for RCI og methylering, manifesteret som kæmpevakuoler i cytoplasmaet48,49. RCI forstyrrer energiproduktionen ved at reducere ATP-produktion, forårsage svigt af ATPase-pumpen eller forstyrre cellemembraner og forårsage en hurtig tilstrømning af Na+, Ca2+ og vand50,51,52. Intracytoplasmatiske vakuoler opstår i dyreceller som følge af væskeophobning i cytoplasmaet på grund af tilstrømningen af Ca2+ og vand53. Interessant nok er denne mekanisme for celleskade reversibel, hvis skaden er midlertidig, og cellerne begynder at producere ATP i en vis periode, men hvis skaden fortsætter eller forværres, dør cellerne.54 Vores observationer viser, at nematoder behandlet med 5-iodoindol ikke er i stand til at genoprette normal biosyntese efter eksponering for stressforhold.
Methyleringsfænotypen induceret af 5-iodindol i B. xylophilus kan skyldes tilstedeværelsen af jod og dets molekylære fordeling, da 7-iodindol havde mindre hæmmende effekt på B. xylophilus end 5-iodindol (Tabel 1 og supplerende figur S6). Disse resultater er delvist i overensstemmelse med studierne af Maltese et al. (2014), som rapporterede, at translokation af pyridylnitrogendelen i indol fra para- til meta-positionen ophævede vakuolisering, væksthæmning og cytotoksicitet i U251-celler, hvilket tyder på, at molekylets interaktion med et specifikt aktivt sted i proteinet er kritisk27,44,45. Interaktionerne mellem indol eller halogenerede indoler og GluCL-receptorer observeret i dette studie understøtter også denne antagelse, da 5- og 2-iodindol viste sig at binde stærkere til GluCL-receptorer end de andre undersøgte indoler (Figur 6 og supplerende figur S8). Jodet i den anden eller femte position af indolen viste sig at binde til leucin 218 på GluCL-receptoren via hydrogenbindinger i rygraden, hvorimod andre halogenerede indoler og indol selv danner svage sidekædehydrogenbindinger med serin 260 (Figur 6). Vi spekulerer derfor i, at lokaliseringen af halogenet spiller en vigtig rolle i induktionen af vakuolær degeneration, hvorimod den tætte binding af 5-iodindol holder ionkanalen åben, hvorved hurtig væsketilstrømning og vakuolebrud muliggøres. Den detaljerede virkningsmekanisme for 5-iodindol er dog stadig ikke fastlagt.
Før praktisk anvendelse af 5-iodoindol bør dets toksiske effekt på planter analyseres. Vores frøspiringsforsøg viste, at 5-iodoindol ikke havde nogen negativ effekt på frøspiring eller efterfølgende udviklingsprocesser ved de undersøgte koncentrationer (Figur 7). Denne undersøgelse giver således et grundlag for brugen af 5-iodoindol i det økologiske miljø til at kontrollere fyrretræernematoders skadelighed for fyrretræer.
Tidligere rapporter har vist, at indolbaseret behandling repræsenterer en potentiel tilgang til at løse problemet med antibiotikaresistens og kræftprogression55. Derudover besidder indoler antibakterielle, anticancer-, antioxidante, antiinflammatoriske, antidiabetiske, antivirale, antiproliferative og antituberkulose-aktiviteter og kan tjene som et lovende grundlag for lægemiddeludvikling56,57. Denne undersøgelse antyder for første gang den potentielle anvendelse af jod som et antiparasitisk og ormemiddel.
Avermectin blev opdaget for tre årtier siden og vandt Nobelprisen i 2015, og dets anvendelse som et ormemiddel er stadig aktivt i gang. På grund af den hurtige udvikling af resistens over for avermectiner hos nematoder og insektskadedyr er der dog behov for en alternativ, billig og miljøvenlig strategi til at bekæmpe fyrretræswot-infektion i fyrretræer. Denne undersøgelse rapporterer også den mekanisme, hvorved 5-iodoindol dræber fyrretræsnematoder, og at 5-iodoindol har lav toksicitet for planteceller, hvilket åbner gode muligheder for dets fremtidige kommercielle anvendelse.
Alle eksperimenter blev godkendt af den etiske komité ved Yeungnam Universitet i Gyeongsan, Korea, og metoderne blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra den etiske komité ved Yeungnam Universitet.
Æg-inkubationsforsøg blev udført ved hjælp af etablerede procedurer43. For at vurdere klækningsrater (HR) blev 1 dag gamle voksne nematoder (ca. 100 hunner og 100 hanner) overført til petriskåle indeholdende svampen og fik lov til at vokse i 24 timer. Æggene blev derefter isoleret og behandlet med 5-iodoindol (0,05 mM og 0,1 mM) eller avermectin (10 μg/ml) som en suspension i sterilt destilleret vand. Disse suspensioner (500 μl; ca. 100 æg) blev overført til brøndene i en 24-brønds vævskulturplade og inkuberet ved 22 °C. L2-tællinger blev foretaget efter 24 timers inkubation, men blev betragtet som døde, hvis cellerne ikke bevægede sig, når de blev stimuleret med en fin platintråd. Dette eksperiment blev udført i to faser, hver med seks gentagelser. Dataene fra begge eksperimenter blev kombineret og præsenteret. Procentdelen af HR beregnes som følger:
Larvedødeligheden blev vurderet ved hjælp af tidligere udviklede procedurer. Nematodeæg blev indsamlet, og embryoner blev synkroniseret ved klækning i sterilt destilleret vand for at generere larver i L2-stadiet. Synkroniserede larver (ca. 500 nematoder) blev behandlet med 5-iodoindol (0,05 mM og 0,1 mM) eller avermectin (10 μg/ml) og opdrættet på B. cinerea Petri-plader. Efter 48 timers inkubation ved 22 °C blev nematoder indsamlet i sterilt destilleret vand og undersøgt for tilstedeværelsen af L2-, L3- og L4-stadierne. Tilstedeværelsen af L3- og L4-stadierne indikerede larvetransformation, hvorimod tilstedeværelsen af L2-stadiet indikerede ingen transformation. Billeder blev erhvervet ved hjælp af iRiS™ Digital Cell Imaging System. Dette eksperiment blev udført i to faser, hver med seks gentagelser. Dataene fra begge eksperimenter blev kombineret og præsenteret.
Toksiciteten af 5-iodoindol og avermectin for frø blev vurderet ved hjælp af spiretest på Murashige og Skoog agarplader.62 B. oleracea og R. raphanistrum frø blev først udblødt i sterilt destilleret vand i én dag, vasket med 1 ml 100% ethanol, steriliseret med 1 ml 50% kommercielt blegemiddel (3% natriumhypochlorit) i 15 minutter og vasket fem gange med 1 ml sterilt vand. De steriliserede frø blev derefter presset på spireagarplader indeholdende 0,86 g/l (0,2X) Murashige og Skoog medium og 0,7% bakteriologisk agar med eller uden 5-iodoindol eller avermectin. Pladerne blev derefter inkuberet ved 22 °C, og billeder blev taget efter 3 dages inkubation. Dette eksperiment blev udført i to faser, der hver havde seks gentagelser.
Opslagstidspunkt: 26. feb. 2025