Tak for dit besøg på Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at opnå de bedste resultater anbefaler vi, at du bruger en nyere version af din browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden viser vi webstedet uden styling eller JavaScript for at sikre løbende support.
Opdagelsen og den gavnlige anvendelse af naturprodukter kan bidrage til at forbedre menneskers liv. Plantevæksthæmmende kemikalier anvendes i vid udstrækning som herbicider til at bekæmpe ukrudt. På grund af behovet for at bruge forskellige typer herbicider er der behov for at identificere forbindelser med nye virkningsmekanismer. I denne undersøgelse opdagede vi en ny N-alkoxypyrrolforbindelse, coumamonamid, fra Streptomyces werraensis MK493-CF1 og etablerede den komplette synteseproces. Gennem biologiske aktivitetsanalyser opdagede vi, at urs-monoaminsyre er et syntetisk mellemprodukt af urs-monoamid og et potentielt ...plantevæksthæmmerDerudover har vi udviklet forskellige urbenonsyrederivater, herunder urbenyloxyderivatet (UDA), som har høj herbicid aktivitet uden at påvirke væksten af HeLa-celler negativt. Vi fandt også, at urmotonsyrederivater forstyrrer plantemikrotubuli; desuden påvirker KAND aktinfilamenter og inducerer celledød; Disse mangesidede effekter adskiller sig fra dem, der findes hos kendte mikrotubuli-hæmmere, og antyder en ny virkningsmekanisme for ursonsyre, hvilket repræsenterer en vigtig fordel i udviklingen af nye herbicider.
Opdagelsen og den praktiske anvendelse af gavnlige naturprodukter og deres derivater er et middel til at forbedre menneskers livskvalitet. Sekundære metabolitter produceret af mikroorganismer, planter og insekter har ført til store fremskridt inden for medicin og landbrug. Mange antibiotika og anti-leukæmilægemidler er blevet udviklet ud fra naturprodukter. Derudover er forskellige typer afpesticider, fungicider og herbicider udvindes fra disse naturprodukter til brug i landbruget. Især ukrudtsbekæmpelsesherbicider er vigtige værktøjer til at øge afgrødeudbyttet i moderne landbrug, og forskellige typer forbindelser anvendes allerede kommercielt. Adskillige cellulære processer i planter, såsom fotosyntese, aminosyremetabolisme, cellevægssyntese, regulering af mitose, fytohormonsignalering eller proteinsyntese, betragtes som typiske mål for herbicider. Forbindelser, der hæmmer mikrotubulifunktionen, er en almindelig klasse af herbicider, der påvirker plantevækst ved at påvirke mitotisk regulering2.
Mikrotubuli er komponenter i cytoskelettet og er bredt konserverede i eukaryote celler. Tubulin-heterodimeren består af α-tubulin og β-tubulin, der danner lineære mikrotubuli-protofilamenter, hvor 13 protofilamenter danner en cylindrisk struktur. Mikrotubuli spiller flere roller i planteceller, herunder bestemmelse af celleform, celledeling og intracellulær transport3,4. Planteceller indeholder mikrotubuli under interfase-plasmamembranen, og disse såkaldte kortikale mikrotubuli menes at kontrollere organiseringen af cellulosemikrofibriller gennem regulering af cellulosesyntasekomplekser4,5. Kortikale mikrotubuli i rod-epidermisceller, der er til stede i zonen med hurtig forlængelse af rodspidsen, er placeret lateralt, og cellulosemikrofibre følger disse mikrotubuli og begrænser retningen af celleekspansion, hvorved anisotrop celleforlængelse fremmes. Derfor er mikrotubulifunktionen tæt forbundet med plantemorfologi. Aminosyresubstitutioner i gener, der koder for tubulin, forårsager skævhed i kortikale mikrotubuli-arrays og venstre- eller højresidig vækst i Arabidopsis 6,7. Tilsvarende kan mutationer i mikrotubuli-associerede proteiner, der regulerer mikrotubulusdynamik, også føre til forvrænget rodvækst 8,9,10,11,12,13. Derudover forårsager behandling med mikrotubuli-forstyrrende herbicider såsom disopyramid, også kendt som pretilachlor, også venstresidig skrå rodvækst 14. Disse data indikerer, at præcis regulering af mikrotubulusfunktionen er afgørende for at bestemme plantens vækstretning.
Forskellige typer mikrotubulihæmmere er blevet opdaget, og disse lægemidler har ydet betydelige bidrag til cytoskeletforskning, såvel som til landbrug og medicin2. Især oryzalin, dinitroanilinforbindelser, disopyramid, benzamidrelaterede forbindelser og deres analoger kan hæmme mikrotubulifunktionen og derved hæmme plantevækst. Derfor anvendes de i vid udstrækning som herbicider. Da mikrotubuli er en vigtig komponent i plante- og dyreceller, er de fleste mikrotubulihæmmere cytotoksiske for begge celletyper. Derfor anvendes et begrænset antal antimikrotubulimidler til praktiske formål på trods af deres anerkendte anvendelighed som herbicider.
Streptomyces er en slægt af familien Streptomyces, som omfatter aerobe, gram-positive, filamentøse bakterier og er bredt kendt for sin evne til at producere en bred vifte af sekundære metabolitter. Derfor betragtes den som en af de vigtigste kilder til nye biologisk aktive naturprodukter. I den aktuelle undersøgelse opdagede vi en ny forbindelse kaldet coumamonamid, som blev isoleret fra Streptomyces werraensis MK493-CF1 og S. werraensis ISP 5486. Ved hjælp af spektralanalyse og fuld spektralanalyse blev strukturen af coumamonamid karakteriseret, og dens unikke N-alkoxypyrrolskelet blev bestemt. Syntese. Ursmonsyre, et syntetisk mellemprodukt af ursmonoamid og dets derivater, viste sig at hæmme væksten og spiringen af den populære modelplante Arabidopsis thaliana. I en struktur-aktivitetsforholdsundersøgelse fandt vi, at en forbindelse med C9 modificeret til ursonsyre, kaldet nonyloxyderivat af ursonsyre (KAND), signifikant forstærker den hæmmende effekt på vækst og spiring. Det er værd at bemærke, at den nyopdagede plantevæksthæmmer også påvirkede væksten af tobak og leverurt og ikke var cytotoksisk for bakterier eller HeLa-celler. Desuden inducerer nogle urmotonsyrederivater en forvrænget rodfænotype, hvilket antyder, at disse derivater direkte eller indirekte påvirker mikrotubuli. I overensstemmelse med denne idé indikerer vores observationer af mikrotubuli mærket enten immunhistokemisk eller med fluorescerende proteiner, at KAND-behandling depolymeriserer mikrotubuli. Derudover forstyrrede behandling med kumamotonsyrederivater aktinmikrofilamenter. Vi har således opdaget en ny plantevæksthæmmer, hvis unikke virkningsmekanisme involverer ødelæggelse af cytoskelettet.
Stamme MK493-CF1 blev isoleret fra jord i Shinagawa-ku, Tokyo. Stamme MK493-CF1 dannede et veldrenget stromalt mycelium. Den delvise sekvens af 16S ribosomalt RNA-genet (1422 bp) blev bestemt. Denne stamme er meget lig S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typisk stamme, 99,93%). Baseret på dette resultat blev det fastslået, at denne stamme var tæt beslægtet med typestammen af S. werraensis. Derfor navngav vi foreløbigt denne stamme S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T producerer også de samme bioaktive forbindelser. Da der var begrænset tidlig forskning i at udvinde naturlige produkter fra denne mikroorganisme, blev der udført yderligere kemisk forskning. Efter dyrkning af S. werraensis MK493-CF1 på bygmedium ved faststoffermentering ved 30°C i 14 dage blev mediet ekstraheret med 50% EtOH. 60 ml prøve blev tørret for at opnå 59,5 mg råekstrakt. Råekstraktet blev underkastet omvendt fase HPLC for at give N-methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid (1, kaldet coumamonamid, 36,0 mg). Den samlede mængde af 1 er cirka 60% af råekstraktet. Derfor besluttede vi at undersøge egenskaberne af kumamotoamid 1 i detaljer.
Coumamonamid 1 er et hvidt amorft pulver, og højopløsningsmassespektrometri (HRESIMS) bekræfter C6H8N2O2 (fig. 1). Det C2-substituerede pyrrolfragment af denne forbindelse er karakteriseret ved δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH i 1H NMR-spektrum: 4,5 Hz, H-5) og δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), og 13C NMR-spektret viser tilstedeværelsen af fire sp2-carbonatomer. Tilstedeværelsen af en amidgruppe ved C2-positionen blev vurderet ved HMBC-korrelation fra C-3-protonen til amidcarbonylcarbonatet ved δC 161,1. Derudover indikerer 1H- og 13C-NMR-toppe ved δH 4,10 (3H, S) og δC 68,3 tilstedeværelsen af N-methoxygrupper i molekylet. Selvom den korrekte position af methoxygruppen endnu ikke var blevet bestemt ved hjælp af spektroskopisk analyse, såsom forbedret differensspektroskopi og nuklear Overhauser-forkortelse (NOEDF), blev N-methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid den første kandidatforbindelse.
For at bestemme den korrekte struktur af 1 blev der udført en totalsyntese (fig. 2a). Behandling af kommercielt tilgængelig 2-aminopyridin 2 med m-CPBA resulterede i det tilsvarende N-oxid 3 i kvantitativt udbytte. Efter 2-aminoazidering af 2 blev cyclokondensationsreaktionen beskrevet af Abramovich udført i benzen ved 90°C for at opnå den ønskede 1-hydroxy-1H-pyrrol-2-carbonitril 5 i gram. Hastighed 60% (to trin). 15,16. Methylering og hydrolyse af 4 gav derefter 1-methoxy-1H-pyrrol-2-carboxylsyre (betegnet "cumotonsyre", 6) i godt udbytte (70%, to trin). Endelig gav amidering via syrechloridmellemprodukt 6 ved anvendelse af vandig ammoniak Kumamoto-amid 1 i 98% udbytte. Alle spektrale data for syntetiseret 1 var lig med isoleret 1, så strukturen af 1 blev bestemt;
Generel syntese og analyse af den biologiske aktivitet af urbenamid og urbensyre. (a) Total syntese af Kumamoto-amid. (b) Syv dage gamle vildtype Arabidopsis Columbia (Col) kimplanter blev dyrket på Murashige og Skoog (MS) plader indeholdende coumamonamid 6 eller coumamonamid 1 i de angivne koncentrationer. Målestok = 1 cm.
Først vurderede vi de biologiske aktiviteter af urbenamid og dets mellemprodukter for deres evne til at modulere plantevækst. Vi tilsatte forskellige koncentrationer af ursmonamid 1 eller ursonsyre 6 til MS agarmedium og dyrkede Arabidopsis thaliana-kimplanter på dette medium. Disse analyser viste, at høje koncentrationer (500 μM) af 6 hæmmede rodvækst (fig. 2b). Dernæst genererede vi forskellige derivater ved at erstatte N1-positionen af 6 og udførte struktur-aktivitetsforholdsstudier på dem (den analoge synteseproces er beskrevet i den supplerende information (SI)). Arabidopsis-kimplanter blev dyrket på et medium indeholdende 50 μM ursonsyrederivater, og rodlængden blev målt, som vist på billedet. Som vist i figur 3a, b og S1 har coumamosyrer forskellige længder af lineære alkoxykæder (9, 10, 11, 12 og 13) eller store alkoxykæder (15, 16 og 17) ved N1-positionen. Derivaterne viste signifikant hæmning af rodvækst. Derudover fandt vi, at tilførsel af 200 μM 10, 11 eller 17 hæmmede spiringen (fig. 3c og S2).
Undersøgelse af struktur-aktivitetsforholdet mellem Kumamoto-amid og relaterede forbindelser. (a) Struktur- og synteseskema for analoger. (b) Kvantificering af rodlængden af 7 dage gamle kimplanter dyrket på MS-medium med eller uden 50 μM coumamonamidderivater. Asterisker angiver signifikante forskelle med sham-behandling (t-test, p< 0,05). n>18. Data er vist som middelværdi ± standardafvigelse. nt betyder "ikke testet", fordi mere end 50 % af frøene ikke spirede. (c) Kvantificering af spirehastigheden for behandlede frø inkuberet i 7 dage i MS-medium med eller uden 200 μM coumamonamid og relaterede forbindelser. Asterisker angiver signifikante forskelle med sham-behandling (chi-kvadrat-test). n=96.
Interessant nok reducerede tilsætningen af alkyl-sidekæder, der var længere end C9, den hæmmende aktivitet, hvilket tyder på, at kumamotosyre-relaterede forbindelser kræver sidekæder af en vis størrelse for at udvise deres biologiske aktivitet.
Fordi struktur-aktivitetsforholdsanalyse viste, at C9 var modificeret til ursonsyre, og at nonyloxyderivatet af ursonsyre (herefter benævnt KAND 11) var den mest effektive plantevæksthæmmer, udførte vi en mere detaljeret karakterisering af KAND 11. Behandling af Arabidopsis med 50 μM KAND 11 forhindrede næsten fuldstændigt spiring, hvorimod lavere koncentrationer (40, 30, 20 eller 10 μM) af KAND 11 hæmmede rodvækst på en dosisafhængig måde (fig. 4a, b). For at teste, om KAND 11 påvirker rodmeristemernes levedygtighed, undersøgte vi rodmeristemer farvet med propidiumiodid (PI) og målte meristemarealets størrelse. Meristemets størrelse hos kimplanter dyrket på et medium indeholdende 25 μM KAND-11 var 151,1 ± 32,5 μm, mens meristemets størrelse hos kimplanter dyrket på et kontrolmedium indeholdende DMSO var 264,7 ± 30,8 μm (fig. 4c, d), hvilket indikerer, at KAND-11 genopretter cellulær aktivitet. Rodmeristem. I overensstemmelse med dette reducerede KAND 11-behandling mængden af celledelingsmarkøren CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signalet i rodmeristemet (fig. 4e)17. Disse resultater indikerer, at KAND 11 hæmmer rodvækst ved at reducere celleproliferationsaktivitet.
Analyse af den hæmmende effekt af urbenonsyrederivater (urbenyloxyderivater) på vækst. (a) 7 dage gamle vildtype Col-kimplanter dyrket på MS-plader med de angivne koncentrationer af KAND 11. Skalalinje = 1 cm. (b) Kvantificering af rodlængde. Bogstaver angiver signifikante forskelle (Tukey HSD-test, p< 0,05). n>16. Data er vist som middelværdi ± standardafvigelse. (c) Konfokalmikroskopi af propidiumiodid-farvede vildtype Col-rødder dyrket på MS-plader med eller uden 25 μM KAND 11. Hvide parenteser angiver rodmeristem. Skalalinje = 100 µm. (d) Kvantificering af rodmeristemstørrelse (n = 10 til 11). Statistiske forskelle blev bestemt ved hjælp af t-test (p< 0,05). Søjlerne repræsenterer den gennemsnitlige meristemstørrelse. (e) Differentialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi af et rodmeristem indeholdende CDKB2-konstruktionen; 1pro: CDKB2; 1-GUS farvet og farvet på 5 dage gamle kimplanter dyrket på MS-plader med eller uden 25 µM KAND-assay.
Fytotoksiciteten af KAND 11 blev yderligere testet ved hjælp af en anden tokimbladet plante, tobak (Nicotiana tabacum), og en vigtig modelorganisme for landplanter, leverurt (Marchantia polymorpha). Ligesom i tilfældet med Arabidopsis producerede tobak SR-1-kimplanter dyrket på medium indeholdende 25 μM KAND 11 kortere rødder (fig. 5a). Derudover spirede 40 ud af 48 frø på plader indeholdende 200 μM KAND 11, hvorimod alle 48 frø spirede på simuleret behandlet medium, hvilket indikerer, at højere koncentrationer af KAND var signifikante (p< 0,05; chi-test -kvadrat) hæmmede tobakkens spiring. (Fig. 5b). Derudover var koncentrationen af KAND 11, der hæmmede bakterievækst i leverurt, lig den effektive koncentration i Arabidopsis (Fig. 5c). Disse resultater indikerer, at KAND 11 kan hæmme væksten af en række forskellige planter. Vi undersøgte derefter den mulige cytotoksicitet af bjørnemonoamidrelaterede forbindelser i andre organismer, nemlig humane HeLa-celler og Escherichia coli-stammen DH5α, som repræsentanter for henholdsvis højere dyre- og bakterieceller. I en række celleproliferationsanalyser observerede vi, at coumamonamid 1, coumamonamidsyre 6 og KAND 11 ikke påvirkede væksten af HeLa- eller E. coli-celler ved koncentrationer på 100 μM (Fig. 5d,e).
Væksthæmning af KAND 11 i ikke-Arabidopsis-organismer. (a) To uger gamle vildtype SR-1 tobaksplantager blev dyrket på vertikalt placerede MS-plader indeholdende 25 μM KAND 11. (b) To uger gamle vildtype SR-1 tobaksplantager blev dyrket på horisontalt placerede MS-plader indeholdende 200 μM KAND 11. (c) To uger gamle vildtype Tak-1 levermoseknopper dyrket på Gamborg B5-plader med de angivne koncentrationer af KAND 11. Røde pile indikerer sporer, der stoppede med at vokse inden for den to ugers inkubationsperiode. (d) Celleproliferationsassay af HeLa-celler. Antallet af levedygtige celler blev målt med faste tidsintervaller ved hjælp af et celletællingskit 8 (Dojindo). Som kontrol blev HeLa-celler behandlet med 5 μg/ml actinomycin D (Act D), som hæmmer RNA-polymerase-transkription og forårsager celledød. Analyserne blev udført i triplikat. (e) E. coli celleproliferationsassay. E. coli-vækst blev analyseret ved at måle OD600. Som kontrol blev cellerne behandlet med 50 μg/ml ampicillin (Amp), som hæmmer syntesen af bakterielle cellevægge. Analyserne blev udført i triplikat.
For at afkode virkningsmekanismen for cytotoksicitet forårsaget af uramid-relaterede forbindelser, analyserede vi urbensyrederivater med moderate hæmmende effekter igen, som vist på billedet. Som vist i figur 2b og 6a producerede kimplanter dyrket på agarplader indeholdende høje koncentrationer (200 μM) urmotonsyre 6 kortere og venstrebuede rødder (θ = – 23,7 ± 6,1), hvorimod kimplanterne dyrket på kontrolmediet producerede næsten lige rødder (θ = – 3,8 ± 7,1). Denne karakteristiske skrå vækst vides at skyldes dysfunktion af kortikale mikrotubuli 14,18. I overensstemmelse med dette fund inducerede de mikrotubuli-destabiliserende lægemidler disopyramid og oryzalin lignende rodkipning under vores vækstbetingelser (fig. 2b og 6a). Samtidig testede vi urmotonsyrederivater og udvalgte flere af dem, der ved bestemte koncentrationer inducerede skrå rodvækst. Forbindelserne 8, 9 og 15 ændrede retningen af rodvækst ved henholdsvis 75 μM, 50 μM og 40 μM, hvilket indikerer, at disse forbindelser effektivt kan destabilisere mikrotubuli (fig. 2b, 6a). Vi testede også det mest potente ursolsyrederivat, KAND 11, ved en lavere koncentration (15 μM) og fandt, at påføring af KAND 11 hæmmede rodvækst, og at retningen af rodvækst var ujævn, selvom de havde en tendens til at hælde til venstre (figur C3). Fordi højere koncentrationer af mikrotubuli-destabiliserende lægemidler nogle gange hæmmer plantevækst snarere end at forårsage rodkipning, vurderede vi efterfølgende muligheden for, at KAND 11 påvirker mikrotubuli ved at observere kortikale mikrotubuli i rod-epidermale celler. Immunhistokemi ved hjælp af anti-β-tubulin-antistoffer i epidermale celler fra kimplanterødder behandlet med 25 μM KAND 11 viste forsvinden af næsten alle kortikale mikrotubuli i epidermale celler i forlængelseszonen (fig. 6b). Disse resultater indikerer, at kumamotonsyre og dens derivater virker direkte eller indirekte på mikrotubuli ved at forstyrre dem, og at disse forbindelser er nye mikrotubuli-hæmmere.
Ursonsyre og dens derivater ændrer kortikale mikrotubuli i Arabidopsis thaliana. (a) Rodhældningsvinkel målt i nærvær af forskellige urmonsyrederivater ved de angivne koncentrationer. Virkningerne af to forbindelser, der vides at hæmme mikrotubuli: disopyramid og oryzalin, blev også analyseret. Indsætningen viser den standard, der bruges til at måle rodvækstvinkel. Stjerner angiver signifikante forskelle med placebobehandling (t-test, p< 0,05). n>19. Målestok = 1 cm. (b) Kortikale mikrotubuli i epidermale celler i forlængelseszonen. Mikrotubuli i vildtype Arabidopsis Col-rødder dyrket på MS-plader med eller uden 25 μM KAND 11 blev visualiseret ved immunhistokemisk farvning ved hjælp af primære β-tubulin-antistoffer og Alexa Fluor-konjugerede sekundære antistoffer. Målestok = 10 µm. (c) Mitotisk struktur af mikrotubuli i rodmeristemet. Mikrotubuli blev visualiseret ved hjælp af immunhistokemisk farvning. Mitotiske strukturer, herunder profasezoner, spindler og fragmoplaster, blev talt fra konfokale billeder. Pile angiver mitotiske mikrotubulistrukturer. Stjerner angiver signifikante forskelle med sham-behandling (t-test, p< 0,05). n>9. Målestok = 50 µm.
Selvom Ursa har evnen til at forstyrre mikrotubulusfunktionen, forventes dens virkningsmekanisme at være forskellig fra typiske mikrotubulusdepolymeriserende midler. For eksempel inducerer højere koncentrationer af mikrotubulusdepolymeriserende midler såsom disopyramid og oryzalin anisotropisk ekspansion af epidermale celler, hvorimod KAND 11 ikke gør. Derudover resulterede samtidig anvendelse af KAND 11 og disopyramid i en kombineret disopyramid-induceret rodvækstrespons, og KAND 11-induceret væksthæmning blev observeret (fig. S4). Vi analyserede også responsen af den overfølsomme disopyramid 1-1 (phs1-1) mutant på KAND 11. phs1-1 har en ikke-kanonisk tubulinkinasepunktmutation og producerer kortere rødder, når den behandles med disopyramid9,20. phs1-1 mutantkimplanter dyrket på agarmedium indeholdende KAND 11 havde kortere rødder svarende til dem, der blev dyrket på disopyramid (fig. S5).
Derudover observerede vi mitotiske mikrotubulistrukturer, såsom profasezoner, spindler og fragmoplaster, i rodmeristemet hos kimplanter behandlet med KAND 11. I overensstemmelse med observationerne for CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS blev der observeret et signifikant fald i antallet af mitotiske mikrotubuli (fig. 6c).
For at karakterisere cytotoxiciteten af KAND 11 ved subcellulær opløsning behandlede vi tobaks BY-2 suspensionsceller med KAND 11 og observerede deres respons. Vi tilsatte først KAND 11 til BY-2 celler, der udtrykker TagRFP-TUA6, som fluorescerende mærker mikrotubuli, for at vurdere effekten af KAND 11 på kortikale mikrotubuli. Kortikal mikrotubuli-tæthed blev vurderet ved hjælp af billedanalyse, som kvantificerede procentdelen af cytoskelettepixels blandt cytoplasmatiske pixels. Assayresultaterne viste, at efter behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 time faldt tætheden signifikant til henholdsvis 0,94 ± 0,74% eller 0,23 ± 0,28%, mens tætheden af celler behandlet med DMSO udgjorde 1,61 ± 0,34% (fig. 7a). Disse resultater er i overensstemmelse med observationen i Arabidopsis, at KAND 11-behandling inducerer depolymerisering af kortikale mikrotubuli (fig. 6b). Vi undersøgte også BY-2-linjen med GFP-ABD-mærkede aktinfilamenter efter behandling med den samme koncentration af KAND 11 og observerede, at KAND 11-behandling ødelagde aktinfilamenterne. Behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 time reducerede signifikant aktinfilamentdensiteten til henholdsvis 1,20 ± 0,62% eller 0,61 ± 0,26%, hvorimod densiteten i DMSO-behandlede celler var 1,69 ± 0,51% (fig. 2). 7b). Disse resultater står i kontrast til virkningerne af propyzamid, som ikke påvirker aktinfilamenter, og latrunculin B, en aktin-depolymerisator, der ikke påvirker mikrotubuli (SI figur S6). Derudover påvirkede behandling med coumamonamid 1, coumamonamidsyre 6 eller KAND 11 ikke mikrotubuli i HeLa-celler (SI figur S7). Det menes således, at virkningsmekanismen for KAND 11 er forskellig fra den for kendte cytoskeletforstyrrende stoffer. Derudover afslørede vores mikroskopiske observation af BY-2-celler behandlet med KAND 11 begyndelsen af celledød under KAND 11-behandling og viste, at andelen af Evans-blåfarvede døde celler ikke steg signifikant efter 30 minutters KAND 11-behandling, hvorimod antallet af døde celler steg til henholdsvis 43,7 % og 80,1 % efter 90 minutters behandling med 50 μM eller 100 μM KAND (fig. 7c). Samlet set indikerer disse data, at det nye ursolsyrederivat KAND 11 er en plantespecifik cytoskelethæmmer med en tidligere ukendt virkningsmekanisme.
KAND påvirker kortikale mikrotubuli, aktinfilamenter og levedygtigheden af tobaks BY-2-celler. (a) Visualisering af kortikale mikrotubuli i BY-2-celler i nærvær af TagRFP-TUA6. BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO blev undersøgt ved konfokalmikroskopi. Kortikal mikrotubulitæthed blev beregnet ud fra mikrografer af 25 uafhængige celler. Bogstaver angiver signifikante forskelle (Tukey HSD-test, p< 0,05). Skalalinje = 10 µm. (b) Kortikale aktinfilamenter i BY-2-celler visualiseret i nærvær af GFP-ABD2. BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO blev undersøgt ved konfokalmikroskopi. Tætheden af kortikale aktinfilamenter blev beregnet ud fra mikrografier af 25 uafhængige celler. Bogstaver angiver signifikante forskelle (Tukey HSD-test, p< 0,05). Skalalinje = 10 µm. (c) Observation af døde BY-2-celler ved Evans-blåfarvning. BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO blev undersøgt ved lysfeltsmikroskopi. n=3. Skalalinje = 100 µm.
Opdagelsen og anvendelsen af nye naturprodukter har ført til betydelige fremskridt inden for forskellige aspekter af menneskelivet, herunder medicin og landbrug. Historisk forskning er blevet udført for at udvinde nyttige forbindelser fra naturressourcer. Især er actinomyceter kendt for at være nyttige som antiparasitiske antibiotika mod nematoder på grund af deres evne til at producere forskellige sekundære metabolitter såsom avermectin, den primære forbindelse i ivermectin og bleomycin og dets derivater, der anvendes medicinsk som et anticancermiddel21,22. Ligeledes er en række herbicide forbindelser blevet opdaget fra actinomyceter, hvoraf nogle allerede anvendes kommercielt1,23. Derfor betragtes analysen af actinomycet-metabolitter for at isolere naturprodukter med ønskede biologiske aktiviteter som en effektiv strategi. I denne undersøgelse opdagede vi en ny forbindelse, coumamonamid, fra S. werraensis og syntetiserede den med succes. Ursonsyre er et syntetisk mellemprodukt af urbenamid og dets derivater. Det kan forårsage karakteristisk rodkrølling, udvise moderat til stærk herbicid aktivitet og direkte eller indirekte skade plantemikrotubuli. Virkningsmekanismen for urmotonsyre kan dog afvige fra virkningsmekanismen for eksisterende mikrotubuli-hæmmere, da KAND 11 også forstyrrer aktinfilamenter og forårsager celledød, hvilket tyder på en reguleringsmekanisme, hvorved urmotonsyre og dens derivater påvirker en bred vifte af cytoskelettestrukturer.
Yderligere detaljeret karakterisering af urbenonsyre vil bidrage til bedre at forstå urbenonsyres virkningsmekanisme. Især er det næste mål at evaluere ursonsyres evne til at binde sig til reducerede mikrotubuli for at bestemme, om ursonsyre og dens derivater virker direkte på mikrotubuli og depolymeriserer dem, eller om deres virkning resulterer i destabilisering af mikrotubuli. Derudover, i tilfælde hvor mikrotubuli ikke er et direkte mål, vil identifikation af virkningsstedet og molekylære mål for ursonsyre på planteceller bidrage til yderligere at forstå egenskaberne af relaterede forbindelser og mulige måder at forbedre herbicid aktivitet på. Vores bioaktivitetsassay afslørede ursonsyres unikke cytotoksiske evne på væksten af planter såsom Arabidopsis thaliana, tobak og leverurt, mens hverken E. coli eller HeLa-celler blev påvirket. Lille eller ingen toksicitet for dyreceller er en fordel ved ursonsyrederivater, hvis de udvikles som herbicider til brug i åbne landbrugsmarker. Da mikrotubuli er almindelige strukturer i eukaryoter, er deres selektive hæmning i planter et centralt krav for herbicider. For eksempel anvendes propyzamid, et mikrotubuli-depolymeriserende middel, der binder sig direkte til tubulin og hæmmer polymerisering, som et herbicid på grund af dets lave toksicitet for dyreceller24. I modsætning til disopyramid har beslægtede benzamider forskellige målspecificiteter. Ud over plantemikrotubuli hæmmer RH-4032 eller benzoxamid også mikrotubuli i henholdsvis dyreceller eller oomyceter, og zalilamid anvendes som et fungicid på grund af dets lave fytotoksicitet25,26,27. Den nyopdagede bjørn og dens derivater udviser selektiv cytotoksicitet mod planter, men det er værd at bemærke, at yderligere modifikationer kan ændre deres målspecificitet og potentielt give yderligere derivater til bekæmpelse af patogene svampe eller oomyceter.
De unikke egenskaber ved urbenonsyre og dens derivater er nyttige til deres udvikling som herbicider og anvendelse som forskningsværktøjer. Cytoskelettets betydning for at kontrollere plantecelleformen er bredt anerkendt. Tidligere undersøgelser har vist, at planter har udviklet komplekse mekanismer for kortikale mikrotubuli-organisering ved at kontrollere mikrotubuli-dynamikken for korrekt at kontrollere morfogenese. Et stort antal molekyler, der er ansvarlige for reguleringen af mikrotubuli-aktivitet, er blevet identificeret, og relateret forskning er stadig i gang3,4,28. Vores nuværende forståelse af mikrotubuli-dynamik i planteceller forklarer ikke fuldt ud mekanismerne for kortikale mikrotubuli-organisering. For eksempel, selvom både disopyramid og oryzalin kan depolymerisere mikrotubuli, forårsager disopyramid alvorlig rodforvrængning, mens oryzalin har en relativt mild effekt. Desuden forårsager mutationer i tubulin, som stabiliserer mikrotubuli, også dextrorotation i rødder, hvorimod paclitaxel, som også stabiliserer mikrotubuli-dynamikken, ikke gør det. Derfor bør undersøgelse og identifikation af de molekylære mål for ursolsyre give ny indsigt i reguleringen af planters kortikale mikrotubuli. Ligeledes vil fremtidige sammenligninger af kemikalier, der er effektive til at fremme forvrænget vækst, såsom disopyramid, og mindre effektive kemikalier, såsom oryzalin eller kumamotorsyre, give spor til, hvordan forvrænget vækst opstår.
På den anden side er forsvarsrelaterede cytoskelette-omlejringer en anden mulighed for at forklare ursonsyres cytotoksicitet. Infektion af et patogen eller introduktion af en elicitor i planteceller forårsager undertiden ødelæggelse af cytoskelettet og efterfølgende celledød29. For eksempel er det blevet rapporteret, at oomycet-afledt kryptoxanthin forstyrrer mikrotubuli og aktinfilamenter før tobakscelledød, svarende til hvad der sker med KAND-behandling30,31. Lighederne mellem forsvarsresponser og cellulære responser induceret af ursonsyre fik os til at antage, at de udløser almindelige cellulære processer, selvom en hurtigere og stærkere effekt af ursonsyre end kryptoxanthin er tydelig. Undersøgelser har imidlertid vist, at forstyrrelse af aktinfilamenter fremmer spontan celledød, som ikke altid ledsages af mikrotubuli-forstyrrelse29. Derudover er det stadig uvist, om enten patogenet eller elicitoren forårsager forvrænget rodvækst, som ursonsyrederivater gør. Således er molekylær viden, der forbinder forsvarsresponser og cytoskelettet, et attraktivt problem, der skal løses. Ved at udnytte tilstedeværelsen af lavmolekylære forbindelser relateret til ursonsyre, samt en række derivater med varierende virkkraft, kan de give muligheder for at målrette ukendte cellulære mekanismer.
Samlet set vil opdagelsen og anvendelsen af nye forbindelser, der modulerer mikrotubulusdynamikken, give effektive metoder til at adressere de komplekse molekylære mekanismer, der ligger til grund for bestemmelsen af plantecellers form. I denne sammenhæng kan den nyligt udviklede forbindelse urmotonsyre, som påvirker mikrotubuli og aktinfilamenter og inducerer celledød, give en mulighed for at afkode forbindelsen mellem mikrotubuluskontrol og disse andre mekanismer. Kemisk og biologisk analyse ved hjælp af urbenonsyre vil således hjælpe os med at forstå de molekylære reguleringsmekanismer, der styrer plantens cytoskelette.
Pod S. werraensis MK493-CF1 i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe med baffel indeholdende 110 ml podemedium bestående af 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) essenspasta, 1% (w/v) Bacto-sammensætning. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) majsekstrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 og 0,2% CaCO3 i deioniseret vand (pH 7,4 før sterilisering). Frøkulturerne blev inkuberet på en rotationsryster (180 rpm) ved 27°C i 2 dage. Produktionsdyrkning via faststoffermentering. Frøkulturen (7 ml) blev overført til en 500 ml K-1-kolbe indeholdende 40 g produktionsmedium bestående af 15 g presset byg (MUSO Co., Ltd., Japan) og 25 g deioniseret vand (pH-værdien var ikke justeret før sterilisering). Fermenteringen blev udført ved 30 °C i mørke i 14 dage. Fermenteringsmaterialet blev ekstraheret med 40 ml EtOH pr. flaske og centrifugeret (1500 g, 4 °C, 10 min). Kultursupernatanten (60 ml) blev ekstraheret med en blanding af 10 % MeOH/EtOAc. Det organiske lag blev inddampet under reduceret tryk for at opnå en rest (59,5 mg), som blev underkastet HPLC med gradienteluering (0-10 minutter: 90%) på en omvendt fasekolonne (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × længde 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minutter: 90% H2O/CH3CN til 70% H2O/CH3CN (gradient), 35-45 minutter: 90% H2O/EtOH, 45-155 minutter: 90% H2O/EtOH til 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) ved en flowhastighed på 1,5 ml/min. Coumamonamid (1, 36,0 mg) blev isoleret som et hvidt amorft pulver.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ beregnet værdi: 141,0659, målt værdi: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-frø (Col-0) blev indhentet fra Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) med tilladelse til forskningsbrug. Col-0-frø blev formeret og vedligeholdt under vores laboratorieforhold og anvendt som vildtype Arabidopsis-planter. Arabidopsis-frø blev overfladesteriliseret og dyrket i halvstyrke Murashige og Skoog-medium indeholdende 2% sukrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethansulfonsyre (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) og 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ved 23 °C og konstant lys. Frø af phs1-1-mutanten blev leveret af T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Frø af stammen SR-1 blev leveret af T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) og anvendt som vildtypetobaksplanter. Tobaksfrøene blev overfladesteriliseret og udblødt i sterilt vand i tre nætter for at fremme spiring, derefter placeret i en halvstyrkeopløsning indeholdende 2% sukrose, 0,05% (w/v) MES og 0,8% gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige og Skoog-medium) med pH 5,7 og inkuberet ved 23°C under konstant lys.
Stamme Tak-1 blev leveret af T. Kohchi (Kyoto Universitet) og blev brugt som standardforsøgsenhed til leverurtundersøgelsen. Gemma blev udtaget fra steriliserede dyrkede planter og derefter udpladet på Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) indeholdende 1% sukrose og 0,3% gellangummi og inkuberet ved 23°C under kontinuerligt lys.
Tobak BY-2-celler (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) blev leveret af S. Hasezawa (University of Tokyo). BY-2-celler blev fortyndet 95 gange i modificeret Linsmeier- og Skoog-medium og suppleret ugentligt med 2,4-dichlorphenoxyeddikesyre 32. Cellesuspensionen blev blandet på en rotationsryster ved 130 rpm ved 27°C i mørke. Vask cellerne med 10 gange volumenet af frisk medium og resuspender i det samme medium. BY-2 transgene cellelinjer, der stabilt udtrykker mikrotubuli-markøren TagRFP-TUA6 eller actinfilamentmarkøren GFP-ABD2 under blomkålsmosaikvirus 35S-promotoren, blev genereret som beskrevet 33,34,35. Disse cellelinjer kan vedligeholdes og synkroniseres ved hjælp af procedurer svarende til dem, der blev brugt til den oprindelige BY-2-cellelinje.
HeLa-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Life Technologies) tilsat 10% føtalt bovint serum, 1,2 U/ml penicillin og 1,2 μg/ml streptomycin i en 37°C inkubator med 5% CO2.
Alle eksperimenter beskrevet i dette manuskript blev udført i overensstemmelse med japanske biosikkerhedsregler og retningslinjer.
Forbindelserne blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) som stamopløsninger og fortyndet i MS-medium til Arabidopsis og tobak eller Gamborg B5-medium til leverurt. Til rodvækstinhiberingsassayet blev mere end 10 frø pr. plade sået på agarmedium indeholdende de angivne forbindelser eller DMSO. Frøene blev inkuberet i et vækstkammer i 7 dage. Kimplanterne blev fotograferet, og røddernes længde blev målt. Til Arabidopsis-spiringsassayet blev 48 frø pr. plade sået på agarmedium indeholdende 200 μM forbindelse eller DMSO. Arabidopsis-frø blev dyrket i et vækstkammer, og antallet af spirede kimplanter blev talt 7 dage efter spiring (dag). Til tobaksspiringsassayet blev 24 frø pr. plade sået på agarmedium indeholdende 200 μM KAND eller DMSO. Tobaksfrø blev dyrket i et vækstkammer, og antallet af spirede kimplanter blev talt efter 14 dage. Til levermostvækstinhiberingsassayet blev 9 embryoner fra hver plade udpladet på agarmedium indeholdende de angivne koncentrationer af KAND eller DMSO og inkuberet i et vækstkammer i 14 dage.
Brug kimplanter farvet med 5 mg/ml propidiumiodid (PI) til at visualisere rodmeristemets organisering. PI-signaler blev observeret ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af et TCS SPE konfokalt laserscanningsmikroskop (Leica Microsystems).
Histokemisk farvning af rødder med β-glucuronidase (GUS) blev udført i henhold til protokollen beskrevet af Malami og Benfey36. Frøplanterne blev fikseret i 90% acetone natten over, farvet med 0,5 mg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-glucuronsyre i GUS-buffer i 1 time og placeret i en hydreret chloraldehydopløsning (8 g chloralhydrat, 2 ml vand og 1 ml glycerol) og observeret ved differentiel interferenskontrastmikroskopi under anvendelse af et Axio Imager M1-mikroskop (Carl Zeiss).
Rodvinkler blev målt på 7 dage gamle kimplanter dyrket på lodret placerede plader. Mål rodens vinkel i forhold til tyngdekraftvektorens retning som beskrevet i trin 6.
Arrangementet af kortikale mikrotubuli blev observeret som beskrevet, med mindre ændringer i protokollen 37. Anti-β-tubulin-antistof (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) og Alexa Fluor 488-konjugeret anti-mus IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) blev anvendt som primære og sekundære antistoffer ved henholdsvis 1:1000 og 1:100 fortyndinger. Fluorescensbilleder blev erhvervet ved hjælp af et TCS SPE konfokalt laserscanningsmikroskop (Leica Microsystems). Optag Z-stack-billeder, og lav projektioner med maksimal intensitet i henhold til producentens instruktioner.
HeLa-celleproliferationsassay blev udført ved hjælp af Cell Counting Kit 8 (Dojindo) i henhold til producentens instruktioner.
Væksten af E. coli DH5α blev analyseret ved at måle celletætheden i kulturen ved hjælp af et spektrofotometer ved 600 nm (OD600).
Cytoskeletal organisering i transgene BY-2-celler blev observeret ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med en CSU-X1 konfokal scanningsenhed (Yokogawa) og et sCMOS-kamera (Zyla, Andor Technology). Cytoskeletdensitet blev vurderet ved billedanalyse, som kvantificerede procentdelen af cytoskeletpixels blandt cytoplasmatiske pixels i konfokale billeder ved hjælp af ImageJ-software som beskrevet38,39.
For at detektere celledød i BY-2-celler blev en aliquot af cellesuspensionen inkuberet med 0,05% Evans-blåt i 10 minutter ved stuetemperatur. Selektiv Evans-blåt-farvning af døde celler afhænger af ekstrudering af farvestoffet fra levedygtige celler via den intakte plasmamembran40. Farvede celler blev observeret ved hjælp af et lysfeltmikroskop (BX53, Olympus).
HeLa-celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS i en befugtet inkubator ved 37°C og 5% CO2. Celler blev behandlet med 100 μM KAND 11, kumamonaminsyre 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) eller 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) i 6 timer ved 37°C. Celler blev fikseret med MetOH i 10 minutter og derefter med acetat i 5 minutter ved stuetemperatur. Fikserede celler blev inkuberet med primært β-tubulin-antistof (1D4A4, Proteintech: 66240-1) fortyndet i 0,5% BSA/PBS i 2 timer, vasket 3 gange med TBST og derefter inkuberet med Alexa Fluor-gedeantistof. 488 1 time. – Mus IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) og 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndet i 0,5% BSA/PBS. Efter tre ganges vask med TBST blev farvede celler observeret på et Nikon Eclipse Ti-E inverteret mikroskop. Billeder blev taget med et afkølet Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera ved hjælp af MetaMorph-software (Molecular Devices).
Opslagstidspunkt: 17. juni 2024