Tak fordi du besøgte Nature.com.Den version af browseren, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For de bedste resultater anbefaler vi, at du bruger en nyere version af din browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre løbende support, viser vi siden uden styling eller JavaScript.
Opdagelsen og den gavnlige brug af naturlige produkter kan hjælpe med at forbedre menneskers liv.Plantevæksthæmmende kemikalier bruges i vid udstrækning som herbicider til at bekæmpe ukrudt.På grund af behovet for at bruge forskellige typer herbicider er der behov for at identificere forbindelser med nye virkningsmekanismer.I denne undersøgelse opdagede vi en ny N-alkoxypyrrolforbindelse, coumamonamid, fra Streptomyces werraensis MK493-CF1 og etablerede den komplette synteseproces.Gennem biologiske aktivitetsassays opdagede vi, at urs-monoaminsyre er et syntetisk mellemprodukt af urs-monoamid og en potentielplantevæksthæmmer.Derudover har vi udviklet forskellige urbenonsyrederivater, herunder urbenyloxyderivatet (UDA), som har høj herbicid aktivitet uden at påvirke væksten af HeLa-celler negativt.Vi fandt også, at urmotonsyrederivater forstyrrer planters mikrotubuli;desuden påvirker KAND actinfilamenter og inducerer celledød;Disse mangefacetterede virkninger adskiller sig fra kendte mikrotubuli-hæmmere og foreslår en ny virkningsmekanisme for ursonsyre, som repræsenterer en vigtig fordel i udviklingen af nye herbicider.
Opdagelsen og den praktiske anvendelse af gavnlige naturprodukter og deres derivater er et middel til at forbedre menneskets livskvalitet.Sekundære metabolitter produceret af mikroorganismer, planter og insekter har ført til store fremskridt inden for medicin og landbrug.Mange antibiotika og anti-leukæmi lægemidler er blevet udviklet fra naturlige produkter.Derudover forskellige typer afpesticider, udvindes fungicider og herbicider fra disse naturlige produkter til brug i landbruget.Især ukrudtsbekæmpelsesherbicider er vigtige redskaber til at øge afgrødeudbyttet i moderne landbrug, og forskellige typer forbindelser anvendes allerede kommercielt.Adskillige cellulære processer i planter, såsom fotosyntese, aminosyremetabolisme, cellevægssyntese, regulering af mitose, fytohormonsignalering eller proteinsyntese, betragtes som typiske mål for herbicider.Forbindelser, der hæmmer mikrotubulus funktion, er en almindelig klasse af herbicider, der påvirker plantevækst ved at påvirke mitotisk regulering2.
Mikrotubuli er komponenter i cytoskelettet og er bredt konserveret i eukaryote celler.Tubulin-heterodimeren består af α-tubulin og β-tubulin, der danner lineære mikrotubuli-protofilamenter, hvor 13 protofilamenter danner en cylindrisk struktur.Mikrotubuli spiller flere roller i planteceller, herunder bestemmelse af celleform, celledeling og intracellulær transport3,4.Planteceller indeholder mikrotubuli under interfase-plasmamembranen, og disse såkaldte kortikale mikrotubuli menes at styre organiseringen af cellulosemikrofibriller gennem regulering af cellulosesyntasekomplekser4,5.Kortikale mikrotubuli af rodepidermale celler, til stede i zonen med hurtig forlængelse af rodspidsen, er placeret lateralt, og cellulosemikrofibre følger disse mikrotubuli og begrænser retningen af celleudvidelse og fremmer derved anisotrop celleforlængelse.Derfor er mikrotubulus funktion tæt forbundet med plantemorfologi.Aminosyresubstitutioner i gener, der koder for tubulin, forårsager skævhed af kortikale mikrotubuli-arrays og venstre- eller højresidig vækst i Arabidopsis 6,7.Tilsvarende kan mutationer i mikrotubuli-associerede proteiner, der regulerer mikrotubulus dynamik, også føre til forvrænget rodvækst8,9,10,11,12,13.Derudover forårsager behandling med mikrotubuli-forstyrrende herbicider som disopyramid, også kendt som pretilachlor, også venstresidet skrå rodvækst14.Disse data indikerer, at præcis regulering af mikrotubulus funktion er afgørende for at bestemme retningen af plantevækst.
Forskellige typer af mikrotubuli-hæmmere er blevet opdaget, og disse lægemidler har ydet betydelige bidrag til cytoskeletforskning samt til landbrug og medicin2.Især oryzalin, dinitroanilinforbindelser, disopyramid, benzamid-relaterede forbindelser og deres analoger kan hæmme mikrotubulus funktion og derved hæmme plantevækst.Derfor er de meget brugt som herbicider.Men da mikrotubuli er en vigtig komponent i plante- og dyreceller, er de fleste mikrotubuli-hæmmere cytotoksiske for begge celletyper.På trods af deres anerkendte anvendelighed som herbicider anvendes et begrænset antal antimikrotubulusmidler derfor til praktiske formål.
Streptomyces er en slægt af familien Streptomyces, som omfatter aerobe, gram-positive, filamentøse bakterier og er kendt for sin evne til at producere en lang række sekundære metabolitter.Derfor betragtes det som en af de vigtigste kilder til nye biologisk aktive naturlige produkter.I den aktuelle undersøgelse opdagede vi en ny forbindelse kaldet coumamonamid, som blev isoleret fra Streptomyces werraensis MK493-CF1 og S. werraensis ISP 5486. Ved hjælp af spektralanalyse og fuld spektralanalyse blev strukturen af coumamonamid karakteriseret og dets unikke N-alkoxypyrrolskelet blev bestemt.syntese.Ursmonsyre, et syntetisk mellemprodukt af ursmonoamid og dets derivater, viste sig at hæmme væksten og spiringen af den populære modelplante Arabidopsis thaliana.I et struktur-aktivitetsforholdsstudie fandt vi ud af, at en forbindelse med C9 modificeret til ursonsyre, kaldet nonyloxyderivat af ursonsyre (KAND), markant forstærker den hæmmende effekt på vækst og spiring.Det er bemærkelsesværdigt, at den nyopdagede plantevæksthæmmer også påvirkede væksten af tobak og leverurt og var ikke cytotoksisk for bakterier eller HeLa-celler.Desuden inducerer nogle urmotonsyrederivater en forvrænget rodfænotype, hvilket antyder, at disse derivater direkte eller indirekte påvirker mikrotubuli.I overensstemmelse med denne idé indikerer vores observationer af mikrotubuli mærket enten immunhistokemisk eller med fluorescerende proteiner, at KAND-behandling depolymeriserer mikrotubuli.Derudover forstyrrede behandling med kumamotonsyrederivater actin-mikrofilamenter.Således har vi opdaget en ny plantevæksthæmmer, hvis unikke virkningsmekanisme involverer ødelæggelse af cytoskelettet.
Stamme MK493-CF1 blev isoleret fra jord i Shinagawa-ku, Tokyo.Stamme MK493-CF1 dannede godt forgrenet stromalt mycelium.Den partielle sekvens af 16S ribosomale RNA-genet (1422 bp) blev bestemt.Denne stamme er meget lig S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typisk stamme, 99,93%).Baseret på dette resultat blev det bestemt, at denne stamme var nært beslægtet med typen af S. werraensis.Derfor navngav vi foreløbigt denne stamme S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T producerer også de samme bioaktive forbindelser.Da der var lidt tidlig forskning i at opnå naturlige produkter fra denne mikroorganisme, blev der udført yderligere kemisk forskning.Efter dyrkning af S. werraensis MK493-CF1 på bygmedium ved faststoffermentering ved 30°C i 14 dage blev mediet ekstraheret med 50% EtOH.60 ml prøve blev tørret til opnåelse af 59,5 mg råekstrakt.Den rå ekstrakt blev underkastet omvendt fase HPLC for at give N-methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid (1, benævnt coumamonamid, 36,0 mg).Den samlede mængde 1 er ca. 60% af råekstraktet.Derfor besluttede vi at studere i detaljer egenskaberne af kumamotoamid 1.
Coumamonamid 1 er et hvidt amorft pulver og højopløsningsmassespektrometri (HRESIMS) bekræfter C6H8N2O2 (fig. 1).Det C2-substituerede pyrrolfragment af denne forbindelse er karakteriseret ved δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH i 1H NMR-spektrum: 4,5 Hz , H-5) og δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), og 13C NMR-spektret viser tilstedeværelsen af fire sp2-carbonatomer.Tilstedeværelsen af en amidgruppe ved C2-positionen blev vurderet ved HMBC-korrelation fra C-3-protonen til amidcarbonylcarbonen ved δC 161,1.Derudover indikerer 1H og 13C NMR-toppe ved δH 4,10 (3H, S) og δC 68,3 tilstedeværelsen af N-methoxygrupper i molekylet.Selvom den korrekte position af methoxygruppen endnu ikke var blevet bestemt ved brug af spektroskopisk analyse såsom forstærket differensspektroskopi og nuklear Overhauser-forkortelse (NOEDF), blev N-methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid den første kandidatforbindelse.
For at bestemme den korrekte struktur af 1 blev en total syntese udført (fig. 2a).Behandling af kommercielt tilgængelig 2-aminopyridin 2 med m-CPBA resulterede i det tilsvarende N-oxid 3 i kvantitativt udbytte.Efter 2-aminoazideringen af 2 blev cyclokondensationsreaktionen beskrevet af Abramovich udført i benzen ved 90°C for at opnå den ønskede 1-hydroxy-1H-pyrrol-2-carbonitril 5 i gram.Hastighed 60% (to trin).15,16.Methylering og hydrolyse af 4 gav derefter 1-methoxy-1H-pyrrol-2-carboxylsyre (benævnt "cumotonsyre", 6) i godt udbytte (70 %, to trin).Endelig gav amidering via syrechloridmellemprodukt 6 under anvendelse af vandig ammoniak Kumamoto-amid 1 i 98 % udbytte.Alle spektraldata for syntetiseret 1 svarede til isoleret 1, så strukturen af 1 blev bestemt;
Generel syntese og analyse af den biologiske aktivitet af urbenamid og urbensyre.(a) Total syntese af Kumamoto-amid.(b) Syv dage gamle vildtype Arabidopsis Columbia (Col) frøplanter blev dyrket på Murashige og Skoog (MS) plader indeholdende coumamonamid 6 eller coumamonamid 1 i de angivne koncentrationer.Målestok = 1 cm.
Først vurderede vi de biologiske aktiviteter af urbenamid og dets mellemprodukter for deres evne til at modulere plantevækst.Vi tilsatte forskellige koncentrationer af ursmonamid 1 eller ursmonsyre 6 til MS-agarmedium og dyrkede Arabidopsis thaliana-kimplanter på dette medium.Disse assays viste, at høje koncentrationer (500 μM) af 6 hæmmede rodvækst (fig. 2b).Dernæst genererede vi forskellige derivater ved at substituere N1-positionen på 6 og udførte struktur-aktivitetsforholdsundersøgelser på dem (den analoge synteseproces er beskrevet i Supporting Information (SI)).Arabidopsis-frøplanter blev dyrket på et medium indeholdende 50 μM ursonsyrederivater, og rodlængden blev målt.som det er vist på billedet.Som vist i figur 3a, b og S1 har coumamosyrer forskellige længder af lineære alkoxykæder (9, 10, 11, 12 og 13) eller store alkoxykæder (15, 16 og 17) ved N1-positionen.Derivaterne viste signifikant inhibering af rodvækst.Derudover fandt vi, at anvendelse af 200 μM 10, 11 eller 17 hæmmede spiring (fig. 3c og S2).
Undersøgelse af struktur-aktivitetsforholdet mellem Kumamoto-amid og beslægtede forbindelser.(a) Struktur og synteseskema af analoger.(b) Kvantificering af rodlængde af 7 dage gamle frøplanter dyrket på MS-medium med eller uden 50 μM coumamonamidderivater.Stjerner indikerer signifikante forskelle med falsk behandling (t-test, s< 0,05).n>18. Data er vist som middel ± SD.nt betyder "ikke testet", fordi mere end 50% af frøene ikke spirede.(c) Kvantificering af spirehastighed for behandlede frø inkuberet i 7 dage i MS-medium med eller uden 200 μM coumamonamid og beslægtede forbindelser.Stjerner indikerer signifikante forskelle med simuleret behandling (chi-square test).n=96.
Interessant nok reducerede tilføjelsen af alkylsidekæder længere end C9 den inhiberende aktivitet, hvilket tyder på, at kumamotoinsyre-relaterede forbindelser kræver sidekæder af en vis størrelse for at udvise deres biologiske aktivitet.
Fordi struktur-aktivitetsforholdsanalyse viste, at C9 var modificeret til ursonsyre, og nonyloxyderivatet af ursonsyre (herefter omtalt som KAND 11) var den mest effektive plantevæksthæmmer, udførte vi en mere detaljeret karakterisering af KAND 11. Behandling af Arabidopsis med 50 μM KAND 11 næsten fuldstændig forhindrede spiring, hvorimod lavere koncentrationer (40, 30, 20 eller 10 μM) af KAND 11 hæmmede rodvækst på en dosisafhængig måde (fig. 4a, b).For at teste, om KAND 11 påvirker rodmeristems levedygtighed, undersøgte vi rodmeristemer farvet med propidiumiodid (PI) og målte meristemarealstørrelsen.Størrelsen af meristemet af frøplanter dyrket på et medium indeholdende 25 μM KAND-11 var 151,1 ± 32,5 μm, mens størrelsen af meristem af frøplanter dyrket på et kontrolmedium indeholdende DMSO var 264,7 ± 30,8 μm (fig. 4c, d) , hvilket indikerer, at KAND-11 genopretter cellulær aktivitet.breder sig.Rodmeristem.I overensstemmelse hermed reducerede KAND 11-behandling mængden af celledelingsmarkør CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signal i rodmeristemet (fig. 4e) 17 .Disse resultater indikerer, at KAND 11 inhiberer rodvækst ved at reducere celleproliferationsaktivitet.
Analyse af den hæmmende virkning af urbenonsyrederivater (urbenyloxyderivater) på vækst.(a) 7 dage gamle vildtype Col-frøplanter dyrket på MS-plader med de angivne koncentrationer af KAND 11. Målestok = 1 cm.(b) Kvantificering af rodlængde.Bogstaver indikerer signifikante forskelle (Tukey HSD-test, s< 0,05).n>16. Data er vist som middel ± SD.(c) Konfokal mikroskopi af propidiumiodid-farvede vildtype Col-rødder dyrket på MS-plader med eller uden 25 μM KAND 11. Hvide parenteser indikerer rodmeristem.Målestok = 100 µm.(d) Kvantificering af rodmeristemstørrelse (n = 10 til 11).Statistiske forskelle blev bestemt ved hjælp af t-test (s< 0,05).Søjlerne repræsenterer den gennemsnitlige meristemstørrelse.(e) Differentiel interferenskontrast (DIC) mikroskopi af et rodmeristem indeholdende CDKB2-konstruktionen;1pro: CDKB2;1-GUS farvet og farvet på 5 dage gamle frøplanter dyrket på MS-plader med eller uden 25 µM KAND-assay.
Fytotoksiciteten af KAND 11 blev yderligere testet under anvendelse af en anden tokimbladet plante, tobak (Nicotiana tabacum) og en stor landplantemodelorganisme, leverurt (Marchantia polymorpha).Som i tilfældet med Arabidopsis producerede tobaks SR-1 frøplanter dyrket på medium indeholdende 25 μM KAND 11 kortere rødder (fig. 5a).Derudover spirede 40 af 48 frø på plader indeholdende 200 μM KAND 11, hvorimod alle 48 frø spirede på mock-behandlede medier, hvilket indikerer, at højere koncentrationer af KAND var signifikante (p< 0,05;chi test -square) hæmmede spiringen af tobak.(Fig. 5b).Derudover svarede koncentrationen af KAND 11, der hæmmede bakterievækst i leverurt, til den effektive koncentration i Arabidopsis (fig. 5c).Disse resultater indikerer, at KAND 11 kan hæmme væksten af en række planter.Vi undersøgte derefter den mulige cytotoksicitet af bjørnemonoamid-relaterede forbindelser i andre organismer, nemlig humane HeLa-celler og Escherichia coli-stamme DH5α, som repræsentanter for henholdsvis højere dyre- og bakterieceller.I en række celleproliferationsassays observerede vi, at coumamonamid 1, coumamonamidsyre 6 og KAND 11 ikke påvirkede væksten af HeLa- eller E. coli-celler ved koncentrationer på 100 μM (fig. 5d, e).
Vækstinhibering af KAND 11 i ikke-Arabidopsis organismer.(a) To uger gamle vildtype SR-1 tobaksfrøplanter blev dyrket på vertikalt placerede MS-plader indeholdende 25 μM KAND 11. (b) To uger gamle vildtype SR-1 tobaksfrøplanter blev dyrket på vandret placeret MS plader indeholdende 200 μM KAND 11. (c) To uger gamle vildtype Tak-1 leverurt knopper dyrket på Gamborg B5 plader med de angivne koncentrationer af KAND 11. Røde pile indikerer sporer, der stoppede med at vokse inden for to ugers inkubation periode.(d) Celleproliferationsassay af HeLa-celler.Antallet af levedygtige celler blev målt med faste tidsintervaller under anvendelse af et celletællingskit 8 (Dojindo).Som kontrol blev HeLa-celler behandlet med 5 μg/ml actinomycin D (Act D), som hæmmer RNA-polymerase-transkription og forårsager celledød.Analyser blev udført i tre eksemplarer.(e) E. coli celleproliferationsassay.E. coli-vækst blev analyseret ved at måle OD600.Som kontrol blev celler behandlet med 50 μg/ml ampicillin (Amp), som hæmmer bakteriel cellevægssyntese.Analyser blev udført i tre eksemplarer.
For at dechifrere virkningsmekanismen for cytotoksicitet forårsaget af uramid-relaterede forbindelser genanalyserede vi urbensyrederivater med moderat hæmmende virkning.som det er vist på billedet.Som vist i figur 2b, 6a producerede frøplanter dyrket på agarplader indeholdende høje koncentrationer (200 μM) af urmotonsyre 6 kortere og venstrebuede rødder (θ = – 23,7 ± 6,1), hvorimod frøplanter dyrket på kontrolmediet frøplanter producerede næsten lige rødder (θ = – 3,8 ± 7,1).Denne karakteristiske skrå vækst er kendt for at skyldes dysfunktion af kortikale mikrotubuli14,18.I overensstemmelse med dette fund inducerede de mikrotubuli-destabiliserende lægemidler disopyramid og oryzalin lignende rodhældning under vores vækstbetingelser (fig. 2b, 6a).Samtidig testede vi urmotonsyrederivater og udvalgte flere af dem, der i visse koncentrationer inducerede skrå rodvækst.Forbindelser 8, 9 og 15 ændrede retningen af rodvækst ved henholdsvis 75 μM, 50 μM og 40 μM, hvilket indikerer, at disse forbindelser effektivt kan destabilisere mikrotubuli (fig. 2b, 6a).Vi testede også det mest potente ursolsyrederivat, KAND 11, ved en lavere koncentration (15 µM) og fandt ud af, at påføring af KAND 11 hæmmede rodvækst, og at rodvækstretningen var ujævn, selvom de havde en tendens til at hælde til venstre ( Figur C3)..Fordi højere koncentrationer af mikrotubuli-destabiliserende lægemidler nogle gange hæmmer plantevækst i stedet for at forårsage rodhældning, vurderede vi efterfølgende muligheden for, at KAND 11 påvirker mikrotubuli ved at observere kortikale mikrotubuli i rodepidermale celler.Immunhistokemi ved anvendelse af anti-β-tubulin antistoffer i epidermale celler fra frøplanterødder behandlet med 25 μM KAND 11 viste forsvinden af næsten alle kortikale mikrotubuli i epidermale celler i forlængelseszonen (fig. 6b).Disse resultater indikerer, at kumamotonsyre og dens derivater virker direkte eller indirekte på mikrotubuli for at forstyrre dem, og at disse forbindelser er nye mikrotubuli-inhibitorer.
Ursonsyre og dens derivater ændrer kortikale mikrotubuli i Arabidopsis thaliana.(a) Rodens hældningsvinkel målt i nærvær af forskellige urmotonsyrederivater ved de angivne koncentrationer.Virkningerne af to forbindelser kendt for at hæmme mikrotubuli: disopyramid og oryzalin blev også analyseret.Indsatsen viser den standard, der bruges til at måle rodvækstvinklen.Stjerner indikerer signifikante forskelle med falsk behandling (t-test, s< 0,05).n>19. Målestok = 1 cm.(b) Kortikale mikrotubuli i epidermale celler i forlængelseszonen.Mikrotubuli i vildtype Arabidopsis Col-rødder dyrket på MS-plader med eller uden 25 μM KAND 11 blev visualiseret ved immunhistokemisk farvning ved hjælp af β-tubulin primære antistoffer og Alexa Fluor-konjugerede sekundære antistoffer.Målestok = 10 µm.(c) Mitotisk struktur af mikrotubuli i rodmeristemet.Mikrotubuli blev visualiseret ved anvendelse af immunhistokemisk farvning.Mitotiske strukturer, herunder profasezoner, spindler og fragmoplaster, blev talt fra konfokale billeder.Pile angiver mitotiske mikrotubulus strukturer.Stjerner indikerer signifikante forskelle med falsk behandling (t-test, s< 0,05).n>9. Målestok = 50 µm.
Selvom Ursa har evnen til at forstyrre mikrotubulus funktion, forventes dens virkningsmekanisme at være forskellig fra typiske mikrotubuli depolymeriserende midler.For eksempel inducerer højere koncentrationer af mikrotubulus-depolymeriserende midler, såsom disopyramid og oryzalin, anisotrop udvidelse af epidermale celler, hvorimod KAND 11 ikke gør.Derudover resulterede co-anvendelse af KAND 11 og disopyramid i en kombineret disopyramid-induceret rodvækstrespons, og KAND 11-induceret væksthæmning blev observeret (fig. S4).Vi analyserede også responsen af den hypersensitive disopyramid 1-1 (phs1-1) mutant på KAND 11. phs1-1 har en ikke-kanonisk tubulinkinase punktmutation og producerer kortere rødder, når den behandles med disopyramid9,20.phs1-1 mutante frøplanter dyrket på agarmedium indeholdende KAND 11 havde kortere rødder svarende til dem, der blev dyrket på disopyramid (fig. S5).
Derudover observerede vi mitotiske mikrotubulistrukturer, såsom profasezoner, spindler og phragmoplaster, i rodmeristem af frøplanter behandlet med KAND 11. I overensstemmelse med observationerne for CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, et signifikant fald i antallet af mitotiske mikrotubuli blev observeret (fig. .6c).
For at karakterisere cytotoksiciteten af KAND 11 ved subcellulær opløsning behandlede vi tobaks BY-2 suspensionsceller med KAND 11 og observerede deres respons.Vi tilføjede først KAND 11 til BY-2-celler, der udtrykker TagRFP-TUA6, som fluorescerende mærker mikrotubuli, for at vurdere effekten af KAND 11 på kortikale mikrotubuli.Kortikal mikrotubuli-densitet blev vurderet ved hjælp af billedanalyse, som kvantificerede procentdelen af cytoskeletale pixels blandt cytoplasmatiske pixels.Analyseresultaterne viste, at efter behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 time, faldt tætheden signifikant til henholdsvis 0,94 ± 0,74 % eller 0,23 ± 0,28 %, mens tætheden af celler behandlet med DMSO, udgjorde 34 ± 10 . % (fig. 7a).Disse resultater er i overensstemmelse med observationen i Arabidopsis, at KAND 11-behandling inducerer depolymerisering af kortikale mikrotubuli (fig. 6b).Vi undersøgte også BY-2-linjen med GFP-ABD-mærkede actinfilamenter efter behandling med den samme koncentration af KAND 11 og observerede, at KAND 11-behandling forstyrrede actinfilamenterne.Behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 time reducerede aktinfilamentdensiteten signifikant til henholdsvis 1,20 ± 0,62 % eller 0,61 ± 0,26 %, hvorimod tætheden i DMSO-behandlede celler var 1,69 % ± 0,69 %.7b).Disse resultater står i kontrast til virkningerne af propyzamid, som ikke påvirker actinfilamenter, og latrunculin B, en actin-depolymerisator, der ikke påvirker mikrotubuli (SI figur S6).Derudover påvirkede behandling med coumamonamid 1, coumamonamidsyre 6 eller KAND 11 ikke mikrotubuli i HeLa-celler (SI figur S7).Virkningsmekanismen for KAND 11 menes således at være forskellig fra den for kendte cytoskeletforstyrrende stoffer.Derudover afslørede vores mikroskopiske observation af BY-2-celler behandlet med KAND 11 begyndelsen af celledød under KAND 11-behandling og viste, at andelen af Evans blåfarvede døde celler ikke steg signifikant efter 30 minutters KAND 11-behandling, hvorimod efter 90 minutters behandling med 50 μM eller 100 μM KAND steg antallet af døde celler til henholdsvis 43,7 % eller 80,1 % (fig. 7c).Tilsammen indikerer disse data, at det nye ursolsyrederivat KAND 11 er en plantespecifik cytoskeletinhibitor med en hidtil ukendt virkningsmekanisme.
KAND påvirker kortikale mikrotubuli, actinfilamenter og levedygtigheden af tobaks BY-2-celler.(a) Visualisering af kortikale mikrotubuli i BY-2-celler i nærvær af TagRFP-TUA6.BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO blev undersøgt ved konfokal mikroskopi.Kortikal mikrotubuli-densitet blev beregnet ud fra mikrofotografier af 25 uafhængige celler.Bogstaver indikerer signifikante forskelle (Tukey HSD-test, s< 0,05).Målestok = 10 µm.(b) Kortikale actinfilamenter i BY-2-celler visualiseret i nærvær af GFP-ABD2.BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO blev undersøgt ved konfokal mikroskopi.Tætheden af kortikale actinfilamenter blev beregnet ud fra mikrofotografier af 25 uafhængige celler.Bogstaver indikerer signifikante forskelle (Tukey HSD-test, s< 0,05).Målestok = 10 µm.(c) Observation af døde BY-2-celler ved Evans blå farvning.BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO blev undersøgt ved lysfeltsmikroskopi.n=3.Målestok = 100 µm.
Opdagelsen og anvendelsen af nye naturlige produkter har ført til betydelige fremskridt inden for forskellige aspekter af menneskers liv, herunder medicin og landbrug.Historisk forskning er blevet udført for at opnå nyttige forbindelser fra naturressourcer.Især er actinomyceter kendt for at være nyttige som antiparasitære antibiotika til nematoder på grund af deres evne til at producere forskellige sekundære metabolitter såsom avermectin, hovedforbindelsen af ivermectin og bleomycin og dets derivater, der anvendes medicinsk som et anticancermiddel21,22.Ligeledes er en række ukrudtsdræbende forbindelser blevet opdaget fra actinomyceter, hvoraf nogle allerede anvendes kommercielt1,23.Derfor betragtes analysen af actinomycetmetabolitter for at isolere naturlige produkter med ønskede biologiske aktiviteter som en effektiv strategi.I denne undersøgelse opdagede vi en ny forbindelse, coumamonamid, fra S. werraensis og syntetiserede den med succes.Ursonsyre er et syntetisk mellemprodukt af urbenamid og dets derivater.Det kan forårsage karakteristisk rodkrølning, udvise moderat til stærk herbicid aktivitet og direkte eller indirekte beskadige planters mikrotubuli.Imidlertid kan virkningsmekanismen for urmotonsyre afvige fra den for eksisterende mikrotubuli-hæmmere, da KAND 11 også forstyrrer actinfilamenter og forårsager celledød, hvilket tyder på en reguleringsmekanisme, hvorved urmotonsyre og dens derivater påvirker en bred vifte af cytoskeletale strukturer..
Yderligere detaljeret karakterisering af urbenonsyre vil bidrage til bedre at forstå virkningsmekanismen af urbenonsyre.Det næste mål er især at evaluere ursonsyrens evne til at binde sig til reducerede mikrotubuli for at bestemme, om ursonsyre og dens derivater virker direkte på mikrotubuli og depolymeriserer dem, eller om deres virkning resulterer i mikrotubuli destabilisering.I tilfælde af, hvor mikrotubuli ikke er et direkte mål, vil identifikation af virkningsstedet og molekylære mål for ursonsyre på planteceller hjælpe yderligere med at forstå egenskaberne af relaterede forbindelser og mulige måder at forbedre herbicid aktivitet på.Vores bioaktivitetsanalyse afslørede ursonsyrens unikke cytotoksiske evne på væksten af planter som Arabidopsis thaliana, tobak og leverurt, mens hverken E. coli eller HeLa-celler var påvirket.Lille eller ingen toksicitet for dyreceller er en fordel ved ursonsyrederivater, hvis de udvikles som herbicider til brug i åbne landbrugsmarker.Da mikrotubuli er almindelige strukturer i eukaryoter, er deres selektive hæmning i planter et nøglekrav for herbicider.For eksempel bruges propyzamid, et mikrotubuli-depolymeriseringsmiddel, der direkte binder til tubulin og hæmmer polymerisering, som et herbicid på grund af dets lave toksicitet over for dyreceller24.I modsætning til disopyramid har beslægtede benzamider forskellige målspecificiteter.Udover plantemikrotubuli hæmmer RH-4032 eller benzoxamid også mikrotubuli af henholdsvis dyreceller eller oomyceter, og zalilamid bruges som fungicid på grund af dets lave fytotoksicitet25,26,27.Den nyopdagede bjørn og dens derivater udviser selektiv cytotoksicitet mod planter, men det er værd at bemærke, at yderligere modifikationer kan ændre deres målspecificitet, hvilket potentielt giver yderligere derivater til kontrol af patogene svampe eller oomyceter.
De unikke egenskaber ved urbenonsyre og dens derivater er nyttige til deres udvikling som herbicider og brug som forskningsværktøjer.Cytoskelettets betydning for at kontrollere plantecelleformen er bredt anerkendt.Tidligere undersøgelser har vist, at planter har udviklet komplekse mekanismer for organisering af kortikal mikrotubuli ved at kontrollere mikrotubulus dynamik for korrekt at kontrollere morfogenesen.Et stort antal molekyler, der er ansvarlige for reguleringen af mikrotubulus aktivitet, er blevet identificeret, og relateret forskning er stadig i gang3,4,28.Vores nuværende forståelse af mikrotubulus dynamik i planteceller forklarer ikke fuldt ud mekanismerne for organisering af kortikal mikrotubuli.For eksempel, selvom både disopyramid og oryzalin kan depolymerisere mikrotubuli, forårsager disopyramid alvorlig rodforvrængning, mens oryzalin har en relativt mild effekt.Desuden forårsager mutationer i tubulin, som stabiliserer mikrotubuli, også dextrorotation i rødder, hvorimod paclitaxel, som også stabiliserer mikrotubuli-dynamikken, ikke gør det.Derfor bør undersøgelse og identifikation af de molekylære mål for ursolsyre give ny indsigt i reguleringen af plantebarkmikrotubuli.Ligeledes vil fremtidige sammenligninger af kemikalier, der er effektive til at fremme forvrænget vækst, såsom disopyramid, og mindre effektive kemikalier, såsom oryzalin eller kumamotoric syre, give fingerpeg om, hvordan forvrænget vækst opstår.
På den anden side er forsvarsrelaterede cytoskeletomlægninger en anden mulighed for at forklare cytotoksiciteten af ursonsyre.Infektion af et patogen eller introduktion af en elicitor i planteceller forårsager nogle gange ødelæggelse af cytoskelettet og efterfølgende celledød29.For eksempel er oomycete-afledt cryptoxanthin blevet rapporteret at forstyrre mikrotubuli og actinfilamenter før tobakscelledød, svarende til hvad der sker med KAND-behandling30,31.Lighederne mellem forsvarsresponser og cellulære responser induceret af ursonsyre fik os til at antage, at de udløser almindelige cellulære processer, selvom en hurtigere og stærkere effekt af ursonsyre end cryptoxanthin er tydelig.Undersøgelser har imidlertid vist, at afbrydelse af actinfilamenter fremmer spontan celledød, som ikke altid er ledsaget af mikrotubulus-afbrydelse29.Derudover mangler det at se, om enten patogenet eller fremkalderen forårsager forvrænget rodvækst, som ursonsyrederivater gør.Molekylær viden, der forbinder forsvarsresponser og cytoskelettet, er således et attraktivt problem, der skal løses.Ved at udnytte tilstedeværelsen af lavmolekylære forbindelser relateret til ursonsyre, samt en række derivater med varierende styrke, kan de give muligheder for at målrette mod ukendte cellulære mekanismer.
Tilsammen vil opdagelsen og anvendelsen af nye forbindelser, der modulerer mikrotubulus dynamik, give effektive metoder til at adressere de komplekse molekylære mekanismer, der ligger til grund for bestemmelse af plantecelleform.I denne sammenhæng kan den nyligt udviklede forbindelse urmotonsyre, som påvirker mikrotubuli og actinfilamenter og inducerer celledød, give mulighed for at tyde sammenhængen mellem mikrotubulikontrol og disse andre mekanismer.Således vil kemisk og biologisk analyse ved hjælp af urbenonsyre hjælpe os med at forstå de molekylære reguleringsmekanismer, der styrer plantens cytoskelet.
Inokuler S. werraensis MK493-CF1 i en 500 ml forblændet Erlenmeyer-kolbe indeholdende 110 ml frømedium bestående af 2 % (vægt/volumen) galactose, 2 % (vægt/volumen) essenspasta, 1 % (vægt/volumen) Bacto-sammensætning .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (vægt/volumen) majsekstrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2 % (vægt/volumen) (NH4)2SO4 og 0,2 % CaCO3 i deioniseret vand.(pH 7,4 før sterilisering).Podekulturerne blev inkuberet på en roterende ryster (180 rpm) ved 27°C i 2 dage.Produktionsdyrkning via faststofgæring.Frøkulturen (7 ml) blev overført til en 500 ml K-1 kolbe indeholdende 40 g produktionsmedium bestående af 15 g presset byg (MUSO Co., Ltd., Japan) og 25 g deioniseret vand (pH ikke justeret) før sterilisering).).Fermentering blev udført ved 30°C i mørke i 14 dage.Fermenteringsmaterialet blev ekstraheret med 40 ml/flaske EtOH og centrifugeret (1500 g, 4°C, 10 min).Kultursupernatanten (60 ml) blev ekstraheret med en blanding af 10% MeOH/EtOAc.Det organiske lag blev inddampet under reduceret tryk for at opnå en rest (59,5 mg), som blev underkastet HPLC med gradienteluering (0-10 minutter: 90%) på en omvendt fase-søjle (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × længde 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minutter: 90% H2O/CH3CN til 70% H2O/CH3CN (gradient), 35-45 minutter: 90% H2O/EtOH, 45-155 minutter: 90% H2O /EtOH til 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) ved en strømningshastighed på 1,5 ml/min blev coumamonamid (1, 36,0 mg) isoleret som et hvidt amorft pulver.
Kumamotoamid(1);1H-NMR (500 MHz, CDCI3) 5 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1 H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1 H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1 H).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCI3) 5 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ beregnet værdi: 141.0659, målt værdi: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 15 cm.
Columbia frø (Col-0) blev opnået fra Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) med tilladelse til forskningsbrug.Col-0 frø blev opformeret og vedligeholdt under vores laboratorieforhold og brugt som vildtype Arabidopsis-planter.Arabidopsis frø blev overfladesteriliseret og dyrket i halvstyrke Murashige og Skoog medium indeholdende 2% saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethansulfonsyre (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) og 1,5 % agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ved 23 °C og konstant lys.Frø af phs1-1 mutanten blev leveret af T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Frø af stamme SR-1 blev leveret af T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) og brugt som vildtype tobaksplanter.Tobaksfrø blev overfladesteriliseret og gennemblødt i sterilt vand i tre nætter for at fremme spiring, derefter anbragt i en halvstyrke opløsning indeholdende 2% saccharose, 0,05% (w/v) MES og 0,8% gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.og Skoog-medium) med pH 5,7 og inkuberet ved 23°C under konstant lys.
Stamme Tak-1 blev leveret af T. Kohchi (Kyoto University) og blev brugt som standard eksperimentel enhed for leverurt studiet.Gemma blev opnået fra steriliserede dyrkede planter og derefter udpladet på Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) indeholdende 1% saccharose og 0,3% gellangummi og inkuberet ved 23°C under kontinuerligt lys.
Tobak BY-2-celler (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) blev leveret af S. Hasezawa (University of Tokyo).BY-2-celler blev fortyndet 95 gange i modificeret Linsmeier- og Skoog-medium og suppleret ugentligt med 2,4-dichlorphenoxyeddikesyre32.Cellesuspensionen blev blandet på en roterende ryster ved 130 rpm ved 27°C i mørke.Vask cellerne med 10 gange volumen af frisk medium og resuspender i det samme medium.BY-2 transgene cellelinjer, der stabilt udtrykker mikrotubulusmarkøren TagRFP-TUA6 eller actinfilamentmarkøren GFP-ABD2 under blomkålsmosaikvirus 35S-promotoren blev genereret som beskrevet33,34,35.Disse cellelinjer kan vedligeholdes og synkroniseres ved anvendelse af procedurer svarende til dem, der anvendes til den originale BY-2-cellelinje.
HeLa-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1,2 U/ml penicillin og 1,2 μg/ml streptomycin i en 37°C inkubator med 5% CO2.
Alle eksperimenter beskrevet i dette manuskript blev udført i overensstemmelse med japanske biosikkerhedsbestemmelser og retningslinjer.
Forbindelser blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) som stamopløsninger og fortyndet i MS-medium til Arabidopsis og tobak eller Gamborg B5-medium til leverurt.Til rodvækstinhiberingsassayet blev mere end 10 frø pr. plade sået på agarmedium indeholdende de angivne forbindelser eller DMSO.Frø blev inkuberet i et vækstkammer i 7 dage.Frøplanterne blev fotograferet, og røddernes længde blev målt.Til Arabidopsis spiringsassay blev 48 frø pr. plade sået på agarmedium indeholdende 200 μM forbindelse eller DMSO.Arabidopsis-frø blev dyrket i et vækstkammer, og antallet af spirede frøplanter blev talt 7 dage efter spiring (dag).Til tobaksspiringsassay blev 24 frø pr. plade sået på agarmedium indeholdende 200 μM KAND eller DMSO.Tobaksfrø blev dyrket i et vækstkammer, og antallet af spirede frøplanter blev talt efter 14 dage.Til leverurt-vækstinhiberingsassayet blev 9 embryoner fra hver plade udpladet på agarmedium indeholdende de angivne koncentrationer af KAND eller DMSO og inkuberet i et vækstkammer i 14 dage.
Brug frøplanter farvet med 5 mg/ml propidiumiodid (PI) til at visualisere rodmeristems organisation.PI-signaler blev observeret ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af et TCS SPE konfokalt laserscanningsmikroskop (Leica Microsystems).
Histokemisk farvning af rødder med β-glucuronidase (GUS) blev udført i henhold til protokollen beskrevet af Malami og Benfey36.Frøplanter blev fikseret i 90 % acetone natten over, farvet med 0,5 mg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-glucuronsyre i GUS-buffer i 1 time og anbragt i en hydratiseret chloraldehydopløsning.(8 g chloralhydrat, 2 ml vand og 1 ml glycerol) og observeret ved differentiel interferenskontrastmikroskopi med et Axio Imager M1-mikroskop (Carl Zeiss).
Rodvinkler blev målt på 7 dage gamle frøplanter dyrket på lodret placerede plader.Mål rodens vinkel fra tyngdekraftvektorens retning som beskrevet i trin 6.
Arrangementet af kortikale mikrotubuli blev observeret som beskrevet med mindre ændringer af protokollen 37 .Anti-β-tubulin antistof (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) og Alexa Fluor 488-konjugeret anti-muse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) blev brugt som primære og sekundære antistoffer ved 1:1000 og 1:100 fortyndinger, henholdsvis.Fluorescensbilleder blev erhvervet ved hjælp af et TCS SPE konfokalt laserscanningsmikroskop (Leica Microsystems).Anskaf Z-stack billeder og skab maksimal intensitet projektioner i henhold til producentens instruktioner.
HeLa-celleproliferationsassay blev udført under anvendelse af Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ifølge producentens instruktioner.
Væksten af E. coli DH5a blev analyseret ved at måle celletæthed i kultur under anvendelse af et spektrofotometer ved 600 nm (OD600).
Cytoskeletorganisation i transgene BY-2-celler blev observeret ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med en CSU-X1 konfokal scanningsenhed (Yokogawa) og et sCMOS-kamera (Zyla, Andor Technology).Cytoskelettæthed blev vurderet ved billedanalyse, som kvantificerede procentdelen af cytoskeletale pixels blandt cytoplasmatiske pixels i konfokale billeder ved hjælp af ImageJ-software som beskrevet38,39.
For at påvise celledød i BY-2-celler blev en alikvot af cellesuspensionen inkuberet med 0,05 % Evans blue i 10 minutter ved stuetemperatur.Selektiv Evans blå farvning af døde celler afhænger af ekstrudering af farvestoffet fra levedygtige celler af den intakte plasmamembran40.Farvede celler blev observeret ved anvendelse af et lysfeltmikroskop (BX53, Olympus).
HeLa-celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS i en befugtet inkubator ved 37°C og 5% CO2.Celler blev behandlet med 100 μM KAND 11, kumamonsyre 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) eller 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) i 6 timer ved 37°C.Celler blev fikseret med MetOH i 10 minutter og derefter med acetat i 5 minutter ved stuetemperatur.Faste celler blev inkuberet med β-tubulin primært antistof (1D4A4, Proteintech: 66240-1) fortyndet i 0,5% BSA/PBS i 2 timer, vasket 3 gange med TBST og derefter inkuberet med Alexa Fluor gedeantistof.488 1 time.– Muse-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) og 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndet i 0,5% BSA/PBS.Efter vask med TBST tre gange blev farvede celler observeret på et Nikon Eclipse Ti-E omvendt mikroskop.Billeder blev taget med et afkølet Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera ved hjælp af MetaMorph-software (Molecular Devices).
Indlægstid: 17-jun-2024