For effektivt atbekæmpe mygog reducere forekomsten af de sygdomme, de bærer, er der behov for strategiske, bæredygtige og miljøvenlige alternativer til kemiske pesticider. Vi evaluerede frømel fra visse Brassicaceae (familien Brassica) som en kilde til planteafledte isothiocyanater produceret ved enzymatisk hydrolyse af biologisk inaktive glucosinolater til brug i bekæmpelsen af egyptiske Aedes (L., 1762). Fem-affedtet frømel (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 og Thlaspi arvense – tre hovedtyper af termisk inaktivering og enzymatisk nedbrydning. Kemiske produkter: Til bestemmelse af toksicitet (LC50) af allylisothiocyanat, benzylisothiocyanat og 4-hydroxybenzylisothiocyanat for Aedes aegypti-larver ved 24 timers eksponering = 0,04 g/120 ml dH2O). LC50-værdier for sennep, hvid sennep og padderokke. Frømel var henholdsvis 0,05, 0,08 og 0,05 sammenlignet med allylisothiocyanat (LC50 = 19,35 ppm) og 4.-Hydroxybenzylisothiocyanat (LC50 = 55,41 ppm) var mere giftigt for larver 24 timer efter behandling end henholdsvis 0,1 g/120 ml dH2O. Disse resultater er i overensstemmelse med produktionen af lucernefrømel. Den højere effektivitet af benzylestere svarer til de beregnede LC50-værdier. Brug af frømel kan give en effektiv metode til mygbekæmpelse. Effektiviteten af korsblomstrede frøpulver og dets vigtigste kemiske komponenter mod myggelarver viser, hvordan de naturlige forbindelser i korsblomstrede frøpulver kan tjene som et lovende miljøvenligt larvicid til mygbekæmpelse.
Vektorbårne sygdomme forårsaget af Aedes-myg er fortsat et stort globalt folkesundhedsproblem. Forekomsten af myggebårne sygdomme spreder sig geografisk1,2,3 og dukker op igen, hvilket fører til udbrud af alvorlig sygdom4,5,6,7. Spredningen af sygdomme blandt mennesker og dyr (f.eks. chikungunya, dengue, Rift Valley-feber, gul feber og Zika-virus) er uden fortilfælde. Denguefeber alene sætter cirka 3,6 milliarder mennesker i risiko for infektion i troperne, med anslået 390 millioner infektioner årligt, hvilket resulterer i 6.100-24.300 dødsfald om året8. Genopkomsten og udbruddet af Zika-virus i Sydamerika har tiltrukket sig verdensomspændende opmærksomhed på grund af den hjerneskade, den forårsager hos børn født af smittede kvinder2. Kremer et al.3 forudsiger, at det geografiske udbredelsesområde for Aedes-myg vil fortsætte med at udvide sig, og at halvdelen af verdens befolkning i 2050 vil være i risiko for infektion med myggebårne arbovirus.
Med undtagelse af de nyligt udviklede vacciner mod denguefeber og gul feber er der endnu ikke udviklet vacciner mod de fleste myggebårne sygdomme9,10,11. Vacciner er stadig tilgængelige i begrænsede mængder og anvendes kun i kliniske forsøg. Bekæmpelse af myggevektorer ved hjælp af syntetiske insekticider har været en nøglestrategi til at kontrollere spredningen af myggebårne sygdomme12,13. Selvom syntetiske pesticider er effektive til at dræbe myg, påvirker den fortsatte brug af syntetiske pesticider ikke-målorganismer negativt og forurener miljøet14,15,16. Endnu mere alarmerende er tendensen til stigende myggers resistens over for kemiske insekticider17,18,19. Disse problemer forbundet med pesticider har accelereret søgningen efter effektive og miljøvenlige alternativer til at bekæmpe sygdomsvektorer.
Forskellige planter er blevet udviklet som kilder til fytopesticider til skadedyrsbekæmpelse20,21. Plantestoffer er generelt miljøvenlige, fordi de er bionedbrydelige og har lav eller ubetydelig toksicitet for ikke-målorganismer såsom pattedyr, fisk og padder20,22. Urtepræparater er kendt for at producere en række bioaktive forbindelser med forskellige virkningsmekanismer til effektivt at bekæmpe forskellige livsstadier af myg23,24,25,26. Planteafledte forbindelser såsom æteriske olier og andre aktive planteingredienser har fået opmærksomhed og banet vejen for innovative værktøjer til at bekæmpe mygvektorer. Æteriske olier, monoterpener og sesquiterpener fungerer som frastødende midler, afskrækkende midler mod føde og ovicider27,28,29,30,31,32,33. Mange vegetabilske olier forårsager døden af myggelarver, pupper og voksne myggearter34,35,36, hvilket påvirker insekternes nervøse, respiratoriske, endokrine og andre vigtige systemer37.
Nylige undersøgelser har givet indsigt i den potentielle anvendelse af sennepsplanter og deres frø som kilde til bioaktive forbindelser. Sennepsfrømel er blevet testet som et biofumigant38,39,40,41 og brugt som jordforbedringsmiddel til ukrudtsbekæmpelse42,43,44 og bekæmpelse af jordbårne plantepatogener45,46,47,48,49,50, plantenæring, nematoder41,51, 52, 53, 54 og skadedyr55, 56, 57, 58, 59, 60. Den svampedræbende aktivitet af disse frøpulvere tilskrives plantebeskyttende forbindelser kaldet isothiocyanater38,42,60. I planter opbevares disse beskyttende forbindelser i planteceller i form af ikke-bioaktive glucosinolater. Når planter imidlertid beskadiges af insekter eller patogeninfektion, hydrolyseres glucosinolater af myrosinase til bioaktive isothiocyanater55,61. Isothiocyanater er flygtige forbindelser, der vides at have bredspektret antimikrobiel og insekticid aktivitet, og deres struktur, biologiske aktivitet og indhold varierer meget mellem Brassicaceae-arter42,59,62,63.
Selvom isothiocyanater udvundet af sennepsfrømel vides at have insekticid aktivitet, mangler der data om biologisk aktivitet mod medicinsk vigtige leddyrvektorer. Vores undersøgelse undersøgte den larvicide aktivitet af fire affedtede frøpulvere mod Aedes-myg. Larver af Aedes aegypti. Formålet med undersøgelsen var at evaluere deres potentielle anvendelse som miljøvenlige biopesticider til myggebekæmpelse. Tre hovedkemiske komponenter i frømelet, allylisothiocyanat (AITC), benzylisothiocyanat (BITC) og 4-hydroxybenzylisothiocyanat (4-HBITC), blev også testet for at teste den biologiske aktivitet af disse kemiske komponenter på myggelarver. Dette er den første rapport, der evaluerer effektiviteten af fire kålfrøpulvere og deres vigtigste kemiske komponenter mod myggelarver.
Laboratoriekolonier af Aedes aegypti (Rockefeller-stamme) blev opbevaret ved 26 °C, 70 % relativ luftfugtighed (RH) og 10:14 timer (L:D-fotoperiode). Parrede hunner blev anbragt i plastikbure (højde 11 cm og diameter 9,5 cm) og fodret via et flaskefodringssystem med citreret bovint blod (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). Blodfodring blev udført som sædvanlig ved hjælp af en membran-multiglasfoderautomat (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) forbundet til et cirkulerende vandbadsrør (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) med temperaturkontrol på 37 °C. Stræk en film af Parafilm M ud på bunden af hvert glasfoderkammer (areal 154 mm2). Hver foderautomat blev derefter placeret på det øverste gitter, der dækkede buret, der indeholdt den parrende hunn. Cirka 350-400 μl bovint blod blev tilsat en glastragt ved hjælp af en Pasteur-pipette (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), og de voksne orme fik lov til at dræne i mindst en time. Drægtige hunner fik derefter en 10% sukroseopløsning og fik lov til at lægge æg på fugtigt filterpapir foret i individuelle ultraklare soufflé-kopper (1,25 fl oz størrelse, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). Placer filterpapiret med æg i en lukket pose (SC Johnsons, Racine, WI) og opbevar ved 26°C. Æggene blev klækket, og cirka 200-250 larver blev opdrættet i plastikbakker indeholdende en blanding af kaninfoder (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) og leverpulver (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA) og fiskefilet (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Tyskland) i forholdet 2:1:1. Larver fra sent tredje instar blev anvendt i vores bioassays.
Plantefrømaterialet, der blev brugt i denne undersøgelse, blev indhentet fra følgende kommercielle og offentlige kilder: Brassica juncea (brun sennep-Pacific Gold) og Brassica juncea (hvid sennep-Ida Gold) fra Pacific Northwest Farmers' Cooperative, Washington State, USA; (Garden Cress) fra Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, USA og Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) fra USDA-ARS, Peoria, IL, USA. Ingen af de frø, der blev brugt i undersøgelsen, blev behandlet med pesticider. Alt frømateriale blev forarbejdet og brugt i denne undersøgelse i overensstemmelse med lokale og nationale regler og i overensstemmelse med alle relevante lokale statslige og nationale regler. Denne undersøgelse undersøgte ikke transgene plantesorter.
Frø af Brassica juncea (PG), lucerne (Ls), hvid sennep (IG) og Thlaspi arvense (DFP) blev malet til et fint pulver ved hjælp af en Retsch ZM200 ultracentrifugalmølle (Retsch, Haan, Tyskland) udstyret med en 0,75 mm maskevidde og en rotor af rustfrit stål, 12 tænder, 10.000 o/min (Tabel 1). Det malede frøpulver blev overført til en papirhåndvask og affedtet med hexan i et Soxhlet-apparat i 24 timer. En delprøve af affedtet marksennep blev varmebehandlet ved 100 °C i 1 time for at denaturere myrosinase og forhindre hydrolyse af glucosinolater til dannelse af biologisk aktive isothiocyanater. Varmebehandlet padderokkefrøpulver (DFP-HT) blev brugt som negativ kontrol ved denaturering af myrosinase.
Glucosinolatindholdet i affedtet frømel blev bestemt i triplikat ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC) i henhold til en tidligere offentliggjort protokol 64. Kort fortalt blev 3 ml methanol tilsat til en 250 mg prøve af affedtet frøpulver. Hver prøve blev sonikeret i et vandbad i 30 minutter og efterladt i mørke ved 23 °C i 16 timer. En 1 ml aliquot af det organiske lag blev derefter filtreret gennem et 0,45 μm filter ind i en autosampler. Glucosinolatindholdet i frømel blev bestemt i triplikat ved hjælp af Shimadzu LC Solution software version 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). Kolonnen var en C18 Inertsil omvendt fasekolonne (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). De indledende mobile fasebetingelser blev indstillet til 12% methanol/88% 0,01 M tetrabutylammoniumhydroxid i vand (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) med en flowhastighed på 1 ml/min. Efter injektion af 15 μl prøve blev de indledende betingelser opretholdt i 20 minutter, og derefter blev opløsningsmiddelforholdet justeret til 100% methanol med en samlet prøveanalysetid på 65 minutter. En standardkurve (nM/mAb-baseret) blev genereret ved serielle fortyndinger af frisk fremstillede sinapin-, glucosinolat- og myrosinstandarder (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for at estimere svovlindholdet i affedtet frømel, glucosinolater. Glucosinolatkoncentrationerne i prøverne blev testet på en Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, USA) ved hjælp af OpenLAB CDS ChemStation-versionen (C.01.07 SR2 [255]) udstyret med den samme kolonne og ved hjælp af en tidligere beskrevet metode. Glucosinolatkoncentrationerne blev bestemt; de skal være sammenlignelige mellem HPLC-systemer.
Allylisothiocyanat (94%, stabilt) og benzylisothiocyanat (98%) blev købt fra Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 4-Hydroxybenzylisothiocyanat blev købt fra ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Når glucosinolater, glucosinolater og glucosinolater enzymatisk hydrolyseres af myrosinase, danner de henholdsvis allylisothiocyanat, benzylisothiocyanat og 4-hydroxybenzylisothiocyanat.
Laboratoriebioassays blev udført i henhold til metoden fra Muturi et al. 32 med modifikationer. Fem fedtfattige frøfodertyper blev anvendt i undersøgelsen: DFP, DFP-HT, IG, PG og Ls. Tyve larver blev placeret i et 400 ml engangsbægerglas med tre dele (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) indeholdende 120 ml deioniseret vand (dH2O). Syv frømelkoncentrationer blev testet for myggelarvetoksicitet: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 og 0,12 g frømel/120 ml dH2O for DFP-frømel, DFP-HT, IG og PG. Foreløbige bioassays indikerer, at affedtet Ls-frømel er mere giftigt end fire andre testede frømeltyper. Derfor justerede vi de syv behandlingskoncentrationer af Ls-frømel til følgende koncentrationer: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 og 0,075 g/120 mL dH2O.
En ubehandlet kontrolgruppe (dH20, intet frømeltilskud) blev inkluderet for at vurdere normal insektdødelighed under assaybetingelser. Toksikologiske bioassays for hvert frømel omfattede tre replikatbægerglas med tre hældninger (20 larver fra sent tredje stadie pr. bægerglas), i alt 108 hætteglas. De behandlede beholdere blev opbevaret ved stuetemperatur (20-21°C), og larvedødeligheden blev registreret i løbet af 24 og 72 timers kontinuerlig eksponering for behandlingskoncentrationer. Hvis myggens krop og vedhæng ikke bevæger sig, når de gennembores eller berøres med en tynd spatel af rustfrit stål, betragtes myggelarverne som døde. Døde larver forbliver normalt ubevægelige i en dorsal eller ventral position i bunden af beholderen eller på vandoverfladen. Eksperimentet blev gentaget tre gange på forskellige dage med forskellige grupper af larver, i alt 180 larver eksponeret for hver behandlingskoncentration.
Toksiciteten af AITC, BITC og 4-HBITC for myggelarver blev vurderet ved hjælp af den samme bioassayprocedure, men med forskellige behandlinger. Forbered 100.000 ppm stamopløsninger for hvert kemikalie ved at tilsætte 100 µL af kemikaliet til 900 µL absolut ethanol i et 2-ml centrifugerør og ryste i 30 sekunder for at blande grundigt. Behandlingskoncentrationerne blev bestemt baseret på vores indledende bioassays, som viste, at BITC var meget mere toksisk end AITC og 4-HBITC. For at bestemme toksiciteten blev 5 koncentrationer af BITC (1, 3, 6, 9 og 12 ppm), 7 koncentrationer af AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 og 35 ppm) og 6 koncentrationer af 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 og 35 ppm) anvendt. Kontrolbehandlingen blev injiceret med 108 μL absolut ethanol, hvilket svarer til det maksimale volumen af den kemiske behandling. Bioassays blev gentaget som ovenfor, hvorved i alt 180 larver blev eksponeret pr. behandlingskoncentration. Larvedødelighed blev registreret for hver koncentration af AITC, BITC og 4-HBITC efter 24 timers kontinuerlig eksponering.
Probitanalyse af 65 dosisrelaterede dødelighedsdata blev udført ved hjælp af Polo-software (Polo Plus, LeOra Software, version 1.0) for at beregne 50% letal koncentration (LC50), 90% letal koncentration (LC90), hældning, letal dosiskoefficient og 95% letal koncentration baseret på konfidensintervaller for letale dosisforhold for log-transformerede koncentrations- og dosis-dødelighedskurver. Dødelighedsdata er baseret på kombinerede replikatdata af 180 larver eksponeret for hver behandlingskoncentration. Probabilistiske analyser blev udført separat for hvert frømel og hver kemisk komponent. Baseret på 95% konfidensintervallet for det letale dosisforhold blev toksiciteten af frømel og kemiske bestanddele for myggelarver betragtet som signifikant forskellig, så et konfidensinterval indeholdende en værdi på 1 var ikke signifikant forskelligt, P = 0,0566.
HPLC-resultaterne for bestemmelsen af de vigtigste glucosinolater i de affedtede frømel DFP, IG, PG og Ls er anført i tabel 1. De vigtigste glucosinolater i de testede frømel varierede med undtagelse af DFP og PG, som begge indeholdt myrosinase-glucosinolater. Myrosininindholdet i PG var højere end i DFP, henholdsvis 33,3 ± 1,5 og 26,5 ± 0,9 mg/g. Ls-frøpulver indeholdt 36,6 ± 1,2 mg/g glucoglycon, hvorimod IG-frøpulver indeholdt 38,0 ± 0,5 mg/g sinapin.
Larver af Ae. Aedes aegypti-myg blev dræbt ved behandling med affedtet frømel, selvom behandlingens effektivitet varierede afhængigt af plantearten. Kun DFP-NT var ikke toksisk for myggelarver efter 24 og 72 timers eksponering (Tabel 2). Toksiciteten af det aktive frøpulver steg med stigende koncentration (Fig. 1A, B). Toksiciteten af frømel for myggelarver varierede signifikant baseret på 95% CI for det letale dosisforhold mellem LC50-værdier ved 24-timers og 72-timers vurderinger (Tabel 3). Efter 24 timer var den toksiske effekt af Ls-frømel større end andre frømelbehandlinger, med den højeste aktivitet og maksimal toksicitet for larver (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larverne var mindre følsomme over for DFP efter 24 timer sammenlignet med behandlinger med IG-, Ls- og PG-frøpulver, med LC50-værdier på henholdsvis 0,115, 0,04 og 0,08 g/120 ml dH2O, hvilket var statistisk højere end LC50-værdien på 0,211 g/120 ml dH2O (Tabel 3). LC90-værdierne for DFP, IG, PG og Ls var henholdsvis 0,376, 0,275, 0,137 og 0,074 g/120 ml dH2O (Tabel 2). Den højeste koncentration af DPP var 0,12 g/120 ml dH2O. Efter 24 timers vurdering var den gennemsnitlige larvedødelighed kun 12 %, mens den gennemsnitlige dødelighed for IG- og PG-larver nåede henholdsvis 51 % og 82 %. Efter 24 timers evaluering var den gennemsnitlige larvedødelighed for den højeste koncentration af Ls-frømelbehandling (0,075 g/120 ml dH2O) 99% (fig. 1A).
Dødelighedskurver blev estimeret ud fra dosisresponset (Probit) for Ae. egyptiske larver (3. instarlarver) på frømelkoncentrationen 24 timer (A) og 72 timer (B) efter behandling. Den stiplede linje repræsenterer LC50 for frømelbehandlingen. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT varmeinaktiveret Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Ved 72 timers evaluering var LC50-værdierne for DFP, IG og PG frømel henholdsvis 0,111, 0,085 og 0,051 g/120 ml dH2O. Næsten alle larver udsat for Ls-frømel døde efter 72 timers eksponering, så dødelighedsdataene var inkonsistente med Probit-analysen. Sammenlignet med andet frømel var larverne mindre følsomme over for DFP-frømelbehandling og havde statistisk set højere LC50-værdier (Tabel 2 og 3). Efter 72 timer blev LC50-værdierne for DFP-, IG- og PG-frømelbehandlinger estimeret til henholdsvis 0,111, 0,085 og 0,05 g/120 ml dH2O. Efter 72 timers evaluering var LC90-værdierne for DFP-, IG- og PG-frømelspulver henholdsvis 0,215, 0,254 og 0,138 g/120 ml dH2O. Efter 72 timers evaluering var den gennemsnitlige larvedødelighed for DFP-, IG- og PG-frømelbehandlingerne ved en maksimal koncentration på 0,12 g/120 ml dH2O henholdsvis 58 %, 66 % og 96 % (fig. 1B). Efter 72 timers evaluering viste det sig, at PG-frømel var mere toksisk end IG- og DFP-frømel.
Syntetiske isothiocyanater, allylisothiocyanat (AITC), benzylisothiocyanat (BITC) og 4-hydroxybenzylisothiocyanat (4-HBITC) kan effektivt dræbe myggelarver. 24 timer efter behandling var BITC mere toksisk for larver med en LC50-værdi på 5,29 ppm sammenlignet med 19,35 ppm for AITC og 55,41 ppm for 4-HBITC (Tabel 4). Sammenlignet med AITC og BITC har 4-HBITC lavere toksicitet og en højere LC50-værdi. Der er signifikante forskelle i myggelarvetoksiciteten af de to vigtigste isothiocyanater (Ls og PG) i det mest potente frømel. Toksicitet baseret på forholdet mellem den dødelige dosis og LC50-værdier mellem AITC, BITC og 4-HBITC viste en statistisk forskel, således at 95% CI for LC50-forholdet for den dødelige dosis ikke inkluderede en værdi på 1 (P = 0,05, Tabel 4). De højeste koncentrationer af både BITC og AITC blev estimeret til at dræbe 100 % af de testede larver (figur 2).
Dødelighedskurver blev estimeret ud fra dosis-responset (Probit) af Ae. 24 timer efter behandling nåede egyptiske larver (3. instarlarver) syntetiske isothiocyanatkoncentrationer. Den stiplede linje repræsenterer LC50 for isothiocyanatbehandling. Benzylisothiocyanat BITC, allylisothiocyanat AITC og 4-HBITC.
Brugen af plantebiopesticider som midler til bekæmpelse af mygvektorer har længe været undersøgt. Mange planter producerer naturlige kemikalier, der har insekticid aktivitet37. Deres bioaktive forbindelser giver et attraktivt alternativ til syntetiske insekticider med stort potentiale til at bekæmpe skadedyr, herunder myg.
Sennepsplanter dyrkes som en afgrøde til deres frø, bruges som krydderi og en kilde til olie. Når sennepsolie udvindes fra frøene, eller når sennep udvindes til brug som biobrændstof, 69 er biproduktet affedtet frømel. Dette frømel bevarer mange af dets naturlige biokemiske komponenter og hydrolytiske enzymer. Toksiciteten af dette frømel tilskrives produktionen af isothiocyanater 55,60,61. Isothiocyanater dannes ved hydrolyse af glucosinolater af enzymet myrosinase under hydrering af frømel 38,55,70 og er kendt for at have svampedræbende, bakteriedræbende, nematicide og insekticide virkninger, samt andre egenskaber, herunder kemiske sensoriske virkninger og kemoterapeutiske egenskaber 61,62,70. Adskillige undersøgelser har vist, at sennepsplanter og frømel virker effektivt som gasningsmidler mod jord og skadedyr i oplagrede fødevarer 57,59,71,72. I denne undersøgelse vurderede vi toksiciteten af firefrømel og dets tre bioaktive produkter AITC, BITC og 4-HBITC for Aedes-myggelarver. Aedes aegypti. Direkte tilsætning af frømel til vand indeholdende myggelarver forventes at aktivere enzymatiske processer, der producerer isothiocyanater, som er giftige for myggelarver. Denne biotransformation blev delvist demonstreret af den observerede larvicide aktivitet af frømelet og tab af insekticid aktivitet, når dværgsennepsfrømel blev varmebehandlet før brug. Varmebehandling forventes at ødelægge de hydrolytiske enzymer, der aktiverer glucosinolater, og derved forhindre dannelsen af bioaktive isothiocyanater. Dette er den første undersøgelse, der bekræfter de insekticide egenskaber af kålfrøpulver mod myg i et vandmiljø.
Blandt de testede frøpulvere var brøndkarsefrøpulver (Ls) det mest toksiske og forårsagede høj dødelighed hos Aedes albopictus. Aedes aegypti-larver blev behandlet kontinuerligt i 24 timer. De resterende tre frøpulvere (PG, IG og DFP) havde langsommere aktivitet og forårsagede stadig betydelig dødelighed efter 72 timers kontinuerlig behandling. Kun Ls-frømel indeholdt betydelige mængder glucosinolater, hvorimod PG og DFP indeholdt myrosinase, og IG indeholdt glucosinolat som det primære glucosinolat (Tabel 1). Glucotropaeolin hydrolyseres til BITC, og sinalbin hydrolyseres til 4-HBITC61,62. Vores bioassayresultater indikerer, at både Ls-frømel og syntetisk BITC er meget giftige for myggelarver. Hovedkomponenten i PG- og DFP-frømel er myrosinaseglucosinolat, som hydrolyseres til AITC. AITC er effektiv til at dræbe myggelarver med en LC50-værdi på 19,35 ppm. Sammenlignet med AITC og BITC er 4-HBITC-isothiocyanat det mindst giftige for larver. Selvom AITC er mindre giftigt end BITC, er dets LC50-værdier lavere end mange æteriske olier, der er testet på myggelarver32,73,74,75.
Vores korsblomstrede frøpulver til brug mod myggelarver indeholder én vigtig glucosinolat, der tegner sig for over 98-99% af de samlede glucosinolater bestemt ved HPLC. Spormængder af andre glucosinolater blev påvist, men deres niveauer var mindre end 0,3% af de samlede glucosinolater. Brøndkarse (L. sativum) frøpulver indeholder sekundære glucosinolater (sinigrin), men deres andel er 1% af de samlede glucosinolater, og deres indhold er stadig ubetydeligt (ca. 0,4 mg/g frøpulver). Selvom PG og DFP indeholder den samme primære glucosinolat (myrosin), varierer den larvicide aktivitet af deres frømel betydeligt på grund af deres LC50-værdier. Varierer i toksicitet over for meldug. Fremkomsten af Aedes aegypti-larver kan skyldes forskelle i myrosinaseaktivitet eller stabilitet mellem de to frøfoderstoffer. Myrosinaseaktivitet spiller en vigtig rolle i biotilgængeligheden af hydrolyseprodukter såsom isothiocyanater i Brassicaceae-planter76. Tidligere rapporter af Pocock et al.77 og Wilkinson et al.78 har vist, at ændringer i myrosinaseaktivitet og -stabilitet også kan være forbundet med genetiske og miljømæssige faktorer.
Det forventede indhold af bioaktive isothiocyanater blev beregnet ud fra LC50-værdierne for hvert frømel efter 24 og 72 timer (Tabel 5) til sammenligning med tilsvarende kemiske anvendelser. Efter 24 timer var isothiocyanaterne i frømelet mere giftige end de rene forbindelser. LC50-værdier beregnet ud fra ppm (parts per million) af isothiocyanat-frøbehandlinger var lavere end LC50-værdierne for BITC-, AITC- og 4-HBITC-anvendelser. Vi observerede larver, der indtog frømelpellets (Figur 3A). Følgelig kan larver blive udsat for mere koncentreret eksponering for giftige isothiocyanater ved at indtage frømelpellets. Dette var mest tydeligt i IG- og PG-frømelbehandlingerne ved 24-timers eksponering, hvor LC50-koncentrationerne var henholdsvis 75 % og 72 % lavere end ved rene AITC- og 4-HBITC-behandlinger. Ls- og DFP-behandlinger var mere giftige end ren isothiocyanat, med LC50-værdier henholdsvis 24 % og 41 % lavere. Larver i kontrolbehandlingen forpuppede sig med succes (fig. 3B), mens de fleste larver i frømelbehandlingen ikke forpuppede sig, og larveudviklingen var signifikant forsinket (fig. 3B, D). I Spodopteralitura er isothiocyanater forbundet med væksthæmning og udviklingsforsinkelse79.
Larver af Ae. Aedes aegypti-myg blev kontinuerligt udsat for Brassica-frøpulver i 24-72 timer. (A) Døde larver med partikler af frømel i munddelene (markeret med cirkler); (B) Kontrolbehandling (dH20 uden tilsat frømel) viser, at larverne vokser normalt og begynder at forpuppe sig efter 72 timer. (C, D) Larver behandlet med frømel; frømelet viste forskelle i udvikling og forpuppede sig ikke.
Vi har ikke undersøgt mekanismen bag isothiocyanaters toksiske virkninger på myggelarver. Tidligere undersøgelser af røde ildmyrer (Solenopsis invicta) har dog vist, at hæmning af glutathion S-transferase (GST) og esterase (EST) er den primære mekanisme for isothiocyanats bioaktivitet, og AITC kan, selv ved lav aktivitet, også hæmme GST-aktivitet. Importerede røde ildmyrer i lave koncentrationer. Dosis er 0,5 µg/ml80. I modsætning hertil hæmmer AITC acetylcholinesterase i voksne majssnudebiller (Sitophilus zeamais)81. Lignende undersøgelser skal udføres for at belyse mekanismen bag isothiocyanats aktivitet i myggelarver.
Vi bruger varmeinaktiveret DFP-behandling til at understøtte forslaget om, at hydrolyse af planteglucosinolater til dannelse af reaktive isothiocyanater fungerer som en mekanisme til bekæmpelse af myggelarver ved hjælp af sennepsfrømel. DFP-HT-frømel var ikke toksisk ved de testede anvendelsesmængder. Lafarga et al. 82 rapporterede, at glucosinolater er følsomme over for nedbrydning ved høje temperaturer. Varmebehandling forventes også at denaturere myrosinase-enzymet i frømel og forhindre hydrolyse af glucosinolater til dannelse af reaktive isothiocyanater. Dette blev også bekræftet af Okunade et al. 75, der viste, at myrosinase er temperaturfølsom, hvilket viser, at myrosinaseaktiviteten blev fuldstændig inaktiveret, når senneps-, sortsenneps- og blodrodsfrø blev udsat for temperaturer over 80° C. Disse mekanismer kan resultere i tab af insekticid aktivitet af varmebehandlet DFP-frømel.
Sennepsfrømel og dets tre vigtigste isothiocyanater er således giftige for myggelarver. I betragtning af disse forskelle mellem frømel og kemiske behandlinger kan brugen af frømel være en effektiv metode til myggebekæmpelse. Der er behov for at identificere egnede formuleringer og effektive leveringssystemer for at forbedre effektiviteten og stabiliteten af brugen af frøpulver. Vores resultater indikerer den potentielle anvendelse af sennepsfrømel som et alternativ til syntetiske pesticider. Denne teknologi kan blive et innovativt værktøj til at bekæmpe myggevektorer. Fordi myggelarver trives i akvatiske miljøer, og frømelsglucosinolater omdannes enzymatisk til aktive isothiocyanater ved hydrering, tilbyder brugen af sennepsfrømel i myggebefængt vand et betydeligt bekæmpelsespotentiale. Selvom isothiocyanaters larvicide aktivitet varierer (BITC > AITC > 4-HBITC), er der behov for mere forskning for at afgøre, om kombinationen af frømel med flere glucosinolater synergistisk øger toksiciteten. Dette er den første undersøgelse, der demonstrerer de insekticide virkninger af affedtet korsblomstret frømel og tre bioaktive isothiocyanater på myg. Resultaterne af denne undersøgelse er banebrydende ved at vise, at affedtet kålfrømel, et biprodukt fra olieudvinding fra frøene, kan tjene som et lovende larvicidt middel til myggebekæmpelse. Denne information kan bidrage til at fremme opdagelsen af plantebaserede biobekæmpelsesmidler og deres udvikling som billige, praktiske og miljøvenlige biopesticider.
De datasæt, der er genereret til dette studie, og de resulterende analyser er tilgængelige fra den korresponderende forfatter efter rimelig anmodning. Ved studiets afslutning blev alle materialer, der blev brugt i studiet (insekter og frømel), destrueret.
Opslagstidspunkt: 29. juli 2024